細菌からのＤＮＡ抽出→ＰＣＲで

質問

初歩的で申し訳ありません。
細菌からＤＮＡを抽出した時そのＤＮＡは環状２重らせんＤＮＡなのでしょうか。
次にＰＣＲで熱をかけた時も解けたＤＮＡは１本ずつ環状のまま解けているのでしょうか？
そして増幅される時はその環状ＤＮＡ全てが複製されるのですか？それとも必要な部分だけ増幅されるのでしょうか？もしかしてプライマーを付けることによって必要な部分だけ増幅しているのですか。

回答No.2

MIYD · ベストアンサー

No1です
>物理的にきれてしまう事
直鎖状DNAの場合は長くなるとせん断力に弱くなるために、
ボルテックスやピペッティングで切れることがあります。
バクテリアの場合は環状DNAのため、
切れにくいとは思いますが、
操作によっては切れる場合はあると思います。

また、切れるのとは別ですが、
プラスミド精製後に電気泳動すると、
ニックが入って移動度が変わるものが見られますので、
二本鎖が両方切れるのではなく、
片方が切れているものはゲノムDNAでも多いのではないかと思います。

>PCR
PCRに用いているDNAポリメラーゼは5'から3'への伸長反応を行う酵素ですので、
(逆に伸長反応を行う酵素はないか、少なくとも一般的なPCRには使えないものだと思います)
結合したプライマーの3'側が増幅されます。
1つのプライマーで増幅したい領域の前後両方に"内向き"に結合できないのであれば、
2つのプライマーで増幅したい領域を"はさむ"必要があります。

この場合は上に書いたとおり、
プライマーの3'側に伸長反応が進むため、
また、通常塩基配列は5'側から3'側に表記するため、

sense鎖側(塩基配列の表記と同じ方向に増えるほう)はDNA配列そのままでいいのですが、
antisense鎖側(表記と逆向きに増えるほう)は相補鎖(GGAATTCならばCAATTCC)を合成しないと
目的の配列が挟まれないために増えません。
プライマー１
　　GAGA→
--GAGA---------------TTTCC---
--CTCT---------------AAAGG---
　　　　　　　　　　　　　　　　←AAAGG
プライマー２
(通常塩基配列は上側の鎖だけで表記されています)
これでPCRを書けると指数関数的に
GAGA---------------TTTCC
CTCT---------------AAAGG
が増幅しますが、

プライマー2をTTTCCのままで作ってしまうと、
直線で増えてしまうため、
30サイクルかけても約30倍にしか増えませんし、
末端が定まらない
GAGA---------------TTTCC---～
TTTCC---～
が増えてしまいます。

お礼

詳しい解説非常に助かりました。
又教えてください。
ありがとうございました。

回答No.1

MIYD

>細菌からＤＮＡを抽出した時そのＤＮＡは環状２重らせんＤＮＡなのでしょうか。

抽出方法にもよりますが、環状2重らせんのままの状態か、切れて線状2重らせんになっているかだと思います。

>ＰＣＲで熱をかけた時も解けたＤＮＡは１本ずつ環状のまま解けているのでしょうか？

2重らせん構造から酵素などによらずに1本ずつ環状になることは通常の状態ではほとんどないと思います。
2本の1本鎖環状DNAが絡んだ状態か、どこかで切れて線状1本鎖DNAになると思います。

>そして増幅される時はその環状ＤＮＡ全てが複製されるのですか？それとも必要な部分だけ増幅されるのでしょうか？もしかしてプライマーを付けることによって必要な部分だけ増幅しているのですか。

PCRの目的によるかと思います。
必要な部分だけ増幅したい場合にはそのようにプライマーや反応条件を設定しますが、
必要な部分だけでなく、目的外の部分も増えることがあります。

お礼

回答ありがとうございます。
抽出時DNAが切れるという事は物理的にきれてしまう事があるのでしょうか。又は一般的に制限酵素等を添加する場合もあるのでしょうか。
プライマーは例えば16S-rRNA領域の遺伝子解析を目的とする場合、その領域に特異的につくようなプライマーをPCRの時に添加するのですか？
又プライマーを２種類入れると聞きましたがその理由はなんでしょうか？前後のプライマーを入れるというような事を聞きましたがよくわかりませんでした。
いろいろ聞いてしまって申し訳ありません。