Digetionが上手くいかなくなりました

質問

今までDigestionで失敗するということは無かったのですが、最近どうも上手くいかなくなりました。

というのも、DNAが無くなるのです。

Large　prepをとった後、
total５０μlのDigestion Mixに0.5μgのDNA　Xho1（NEB）１μl　Buffer　5μl　BSA　0.5μl　を入れ３７℃でincubateし、チェックすると無くなるのです。
（切る前のDNAを試しに流したところ、ちゃんと確認できました）

何かのコンタミかと、思ったのでdigestionに使用してる試薬、水、Dye Agarose gel 泳動buffer などを変えてもう1回してみたところやはり無くなりました。

結局
DNA溶液自体のコンタミかと思ったので、水とDNAのみのものを３７℃でincubateし泳動すると、バンドが見えたので、DNA溶液のコンタミではないと思います。

ほかのDNAをxho1を使って切ったら（EcoRIとのdouble digestionなのですが・・・）、バンドが見えました

原因がわからず、困り果ててます。どなたか、私の間違いに気づかれた方、回答よろしくお願いいたします。

回答No.3

umeru · ベストアンサー

#2です。
私は学生で専門家ではないので、明確な回答を示すことが出来ません。間違ってるかもしれませんので、それを踏まえてご参考ください。

TAKARAとTOYOBOしか使ったことがないので、わかりませが。TAKARAの場合、1μgに対して3-5Uが基本だと思ってましたから、かなり多いかと思います。私の場合は、ミニプレ産物（プラスミド）1μlに対して、制限酵素0.1μl（P2やU2のピペットマンで強制的に測り取る）で2h反応させています。（Highコピープラスミドの場合ですが）
DNAが切れにくい場合は、UNIT数をあげるよりも長時間反応させたほうがよいのではないでしょうか。DNAに対する制限酵素量はあるところから飽和状態に達するからです。

うちの教授が言うには「制限酵素がDNAに結合してDNAを切断した後も、解離せずにDNAにくっついたままである場合がある。その際、BSAなどの添加でタンパク質濃度が高いほどそういう現象がおきやすい」と申しておりました。それ以上のことはわかりません＾＾；

ただ、その後にLigationに持っていく場合などは、SDSが入っているとダメなので、SDSは入れないほうがいいという先生もおられます。私は、SDS入りでもLigationやってしまいますが。
電気泳動にかけるまえに、フェノクロエタチンをするのも手かと・・・。

お礼

今日早速してみたのですが、５UにXho１を加えてもウェルにたまっているものは見えるのですがバンドが見えませんでした。
２０U、５U作ったうち２０UのサンプルにおっしゃられたとおりSDSを0.1％入れたらバンドが見えてウェルの発光がなくなってるんです！！
やはり、過剰に入れたため泳動に支障が生じたみたいです。５Uでも見えないのはなぞですが・・・。Xho1はそんなにDNAと結合しやすいんでしょうかね？

なんにせよ、本当に助かりました。
丁寧かつわかりやすい解説、どうもありがとうございました！！！

回答No.4

geneticist12

プラスミド精製が十分ではなく、nucleaseが残存している可能性がまず考えられます。プラスミドをフェノール抽出して再精製するか、65-70℃で15分ほど処理して酵素の失活を図ってみてください。

また、消化後に熱による失活処理をしていたりしませんか？
XhoI（特にNEBの）は消化後に熱失活させようとすると、スター活性のせいか、コンタミしているnucleaseのせいかDNAの分解が起こることを経験しています。

酵素量は問題が生じるほど過剰だとは思えませんが、nucleaseがコンタミしている可能性があるとすると、反応時間は一時間で終了するなど、最小限にしておいたほうが良いと思います。

お礼

水とDNA溶液のみのものをincubateしたものも泳動したものは見えたんです。
プラスミドはキアゲンで精製しました。

DyeにSDSを0.1%加えるとDNAが見えたので
どうやら、コンタミではなく酵素量過剰のためDNAに結合し泳動に支障をきたしていたということが、今日わかりました。

ご丁寧に解説ありがとうございました。

回答No.2

umeru

自信はあまりないのですが、
DNA量に対して酵素量が多いときは（今回はタンパク質としてBSAも入ってるみたいですし）、DNAにタンパク質が結合して電気泳動の時に、流れないことがよくあります。
ウェルの中にDNAが溜まったままで、UVあてたらウェルが光るような場合や、なんで？？って思うようなスメアなバンドがでることがあります。

そういった症状であれば、あらかじめLoading Dyeの中に、終濃度0.01%になるようにSDSを入れておきます。そうすると、DNAとタンパク質が解離してきれいなバンドがでます。

他のDNAをXhoIで切ったらうまくいくということなので、私の仮説はあてはまらないのかもしれません。

補足

そうなんです！！おっしゃるとおりで、、最近なのですが、バンドが見えない代わりにスメアがでたり、ウェル中にぜったい光るものがあるんです！マーカーのウェルにはいつも、何も見えないのにサンプルのウェルにだけ絶対何か、光るものが混在してるんです！

ゲルの保存状態が悪く何かコンタミしているのか、ゲル自体がおかしいのかと迷いまくってたのですが・・・、0.5μｇのDNAをtotal５０μｌの反応液に対して２０Uじゃ多すぎですよね？　

あと、なぜ多すぎるとDNAにタンパクがくっ付くのでしょうか？
質問ばかりですいませんが、よろしくお願いします

回答No.1

MIYD

0.5ugに20U入れたからといって、
そこまでスター活性が出ることはないと思いますが、
もし、一晩反応しているのでしたら、1時間で止めてみてはいかがでしょうか。

とりあえず、XhoIがおかしい可能性をなくすために、
DNA,buffer,BSA,DDWまでのmixを作って、
それを半分に分けて、片方にXhoIを入れてもう片方をコントロールにしてみてはいかがでしょうか。

同時にポジコンとして水だけのものも作っておくと、他の試薬が原因なのかもわかると思います。

可能ならば近所のラボから少しXhoIを貰ってコントロールを作るのもいいと思います。
それで自分のラボのXhoIがおかしいことがわかったら、ちょっと困りますね。
メーカーにクレームを言って変えてくれればいいのですが‥

補足

回答ありがとうございます

それが、反応時間は１ｈなんです。

もちろんXho1も今まで使っていたものとは別のものを
使用したサンプルも作ったのですが、消えてしまいました。

水とDNAのものを作り37℃、1hで反応させたのですがそれはバンドが確認できたんです。（水は今まで使用してたもの）

なので、水の可能性はないかと。

もう一回新しくXhoIを買いなおして見るか、ほかのDNAはどうなのか、チェックしてみようとは思います、、、また、お気づきの点があれば回答よろしくお願いします