agarose gell作製にあたって

質問

genomic DNAをPCRで増やして電気泳動する際に使うゲルを作るとき、アガロースをEtBr入りのBufferで溶媒とし、レンジで温めて溶かすのですが、その際沸騰させてはまずいでしょうか？
EｔBrが失活してしまうということはありますか？
基本的なことで申し訳ないですが、教えてください！

回答No.2

Dr_Hyper · ベストアンサー

学生にはbufferに最初から入れることは基本的にしないように指導しますが、熱分解が問題ではなく飛散が問題になるからです。熱で分解するのであれば暖め直すなどのときにどんどん退色していくでしょう。たかだか１００℃程度ですし。
染まるか染まらないかのぎりぎりの濃度で厳密な実験をしているならばともかく、ゲルに保持させて流れるDNAが染色されるような大過剰のエチブロを入れているのですから色が明らかになくなったなど見た目でわかる程度の実験だと思います。それとも沸騰させている間に明らかに色が退色しますか？もしかしたらpH、塩濃度などの違いで起こるかもしれませんが、泳動ブッファーは標準的なものですよね。
また質問者さんはbufferにエチブロがはいっているとのこと、つまり泳動バッファーにも入っているということですよね。もし泳動バッファーがべつであれば、そちらでゲルを溶かしてエチブロを入れれば良いし、全部一緒だったら泳動している間に染まっているので、さらに問題ないように思います。
老婆心ながら、もし鮮明に見えなくて沸騰が気になっているのであれば、エチブロをあきらめてSYBR greenなどUV化でも見える蛍光色素を購入する方が１０倍程度の感度の上昇が見込めます。

お礼

結論としては直接影響しないってことですね！
泳動Bufferもゲル作製用のと同様です。では更に問題ないですね。
ありがとうございました！

回答No.3

noname#160718

質問者さんのラボがEtBrをBufferに入れて使っていたということは、沸騰による退色がなかったからなのでしょうね。
　作り置きしておいたアガロースゲルを溶かすときは、沸騰させないと細かい気泡が入ってしまいますから、もし沸騰させたくないとなると湯洗で長時間かけて溶かすかオートクレーブの溶解モード(100℃30min→70℃Hold etc..)を使うしかないでしょう。

　染まりの問題ですが、アガロースゲルにEtBrを仕込むより、普通にゲルを作ってEtBr(1/10000)で染色した方が綺麗に染色できます。理由はちょっと忘れましたが・・・
　当然この場合、BufferにEtBrを仕込むのもなし、です。

　それとBufferですが、バンドをクリアに観察するだけでしたら、確かTBEの方が良かったかと記憶しています。切り出してサブクローニングなどをする場合はTAEの方が良い、と憶えています。これも理由は忘れてしまいましたが・・・

お礼

そうですよね・・影響があれば後から入れるシステムにしていたはずです。あとからEtBrで染色なんて方法もあるんですね～
ありがとうございました！

回答No.1

sachihappy777

アガロースゲルをレンジで作製する際は、エチブロは後から入れています。
エチブロがレンジ内に飛び散るのは気分的に嫌ですので・・
（共用のレンジということもありますし）

沸騰の件ですが、1～2分沸騰させて、空気を抜くようにしています。

エチブロが失活するかはわからないので一度そのゲルで泳動してみてはわかるのではないでほうか。

お礼

私の研究室ではすでにBufferにエチブロを入れて作っているので、後入れはあまりしていません。（レンジはそれ専用）
沸騰は空気抜きにはいいのですね。

やはり知りたいのはエチブロが沸騰によって質的に問題があるかないかです。いつもある程度沸騰させてしまって使ってますが、長い間沸騰させないように気をつければバンドがより鮮明に見えるようになるか分かる方いたら教えてください。
ありがとうございました。