ラージスケール

質問

ラージスケールでDNAを回収したいのですが、回収量がものすごく少なく(最後にTEに溶かして保存するのですが、そのTE量が30μl程度)、回収したものを電気泳動で確認するとスメア状になってしまいバンドを確認することができません。ミニプレップの時はキレイにバンドが確認でき、それからラージスケールを行っています。
LB100mlに対して大腸菌培養液を1ml入れていました。その量が少ないのかと思い、先に10mlLBで培養したものを100mlに移して本培養しています(培養時間は17時間程度)。それでも回収量が多くなることがないし、電気泳動で確認してもうまくいっていません。
何か解決策があればお願いします。

回答No.3

dadachan · ベストアンサー

ミニプレップで確認できたということですが、私はラージスケールに持って行く場合には、ミニプレップで配列が確認されたサンプル（DNA溶液）をもう一度大腸菌に入れなおし、フレッシュな大腸菌からラージスケールのサンプルを取るようにしています。

大腸菌のフレッシュさによって得られるDNA量って結構変わってきますよ。

あと、欲張りすぎていませんか？
えてして回収量が少ない場合は、最初の大腸菌量が多すぎる、という事があります。
欲張った分多く取れると思いがちですが、きちんとそのkitなりに指定されている量にとどめ、欲張らないようにしてくださいね。

私も、高発現細胞作成などの場合、大量に取っても結局使う量はたかが知れていますので、ミニプレップを数回やったものをエタ沈して使う事はよくあります。
なので、ミニプレップがうまく行っているのであれば、それを大量に（どの程度必要なのかわかりませんが）やればいいんですよ。

あと、得られたものがスメア状になるとありますが、一体何のDNAをとっているのでしょうか？
もしかしたら、RNAseが十分働いていないとか、コンタミンがあったりしませんか？

補足

ラージスケールにはフレッシュなものを使用していますが、なんせ素人なもので多少欲張りすぎているかもしれません(^^;)地道に頑張ります。

今は酵母のDNAを取ろうとしています。DNAによって回収量の差が大きく、同じ研究室内でも私が一番少ない回収量です。
コンタミは十分に考えられると思います。注意してやっていても、「慣れ」が出てきてしまい雑になっているのかもしれません。RNAseは研究室内で同じものをみんなが使用していますので特別働かなくなっているとは考えにくいです。RNAseの時間が短いのでしょうか?(今は37度・30分でやっています)

回答No.4

joyjoyjo

酵母の遺伝子をもったプラスミドの回収という理解でよろしいでしょうか？
大腸菌にとっては外来遺伝子となるので、場合によっては生育等に不適切な遺伝子となることがあります。
この場合、大腸菌が十分に生育しなかったり、プラスミドを落としたりして、収量が少なくなることがあります。
この点は、ミニプレップで他のplasmidと同じような量が取れていれば問題ないかと思います。

スメアーになるというのが気になります。
DNaseの混入は大丈夫でしょうか？
この場合、プラスミドが切れていてスメアーになっていることを気にしてます。
また、solution IIを入れたときに、voltex等で激しく振ってないでしょうか？
この場合、ゲノムDNAが混入してスメアーになっていることを気にしてます。
あと、大腸菌は本当にDH5アルファでしょうか？

収量が少なければ、皆さん言うようにミニプレップの回数を増やすのも手です。
あと、思い切って500 ml位までスケールを上げて、最後はセシウムクロライドによる超遠心によって余計なもは全て落とすという手があります。
この場合、solution Iを入れたときに、10 mg/ml　リゾチーム(in solution I)を0.6 ml加えておきます。
どちらも手間がかかる力技となると思います。
一番楽なのは、キットを使って、プロトコール通りにやることです。

回答No.2

MIYD

一番疑わしいのはリシスのステップだと思います
スケールアップした分、
菌体量が多くなり、
うまく溶菌できていない可能性が高いと思います

チェックするには、
ラージスケールで増やした培地から1mlとってミニプレップしてみると、
(残りはペレットにしておく)
問題があるのが培養時なのかプラスミド調製時なのかがわかると思います

スメアやベクターのサイズや、
ベクターがデリーションしやすいものなのかがわからないので、
スメアがベクター由来かゲノム由来かRNAなのかがわかりませんが、
デリーションしにくいベクターでしたら
2リットル位振って超遠心した方が綺麗にとれるかもしれません

デリーションによってスメアになっているのでしたら、
培養温度を下げたり、
大腸菌の株を変える必要がでてくるかもしれません

お礼

「ラージスケールで増やした培地から1mlとってミニプレップしてみる」というのは思いつきませんでした！今度やってみます。
丁寧な回答ありがとうございました。

回答No.1

MIYD

大腸菌の培養か、プラスミドの調整法に問題があるような気がします。
PACやBACを回収しようとして、ゲノムしかとれていない状況なのでしょうか。

プラスミド(のori)と大腸菌株は何ですか？
入れている抗生物質の種類と濃度は適切ですか？
本カルチャーのときに抗生物質を入れてないということはありませんか？
回収方法は何ですか？

多分問題解決とはつながらないと思いますが、
スメア状になる位置はどのあたりですか？
目的の位置にバンドはうっすらとでも見えているのですか？

そのあたりの情報を書くことができないのでしたら、

1mlでうまく行っているのでしたら1mlの培養を100本おこない、
それをまとめてラージスケールのプラスミド回収を行うか、
最後まで100本でミニプレップをした後で、まとめてエタ沈することで解決できると思います。

補足

大腸菌株はDH5αを塩化カルシウム法で調整したコンピテント細胞を使用しています。抗生物質は適切なものを適切な量で使用しています。
回収法はアルカリSDS法で行っています。
ミニプレップと同様の位置に薄っすらと(かなり目を凝らして見ないと分からないぐらい)あるような状態で全体的にスメア状になっていて、場合によってはバンドが全く見えないこともあります。サンプルが濃いのかと思い、少し薄めて電気泳動してみたら、薄める前よりもヒドイ状態でした。