遺伝子発現の際の大腸菌宿主の選び方

質問

tac promotor の下流に発現させたいgene　があるのですが、発現量が非常に少なくて困っています．control 発現タンパク質としてBAP (bacterial alkaliphosphatase)を使用していて、そちらの方は大量に発現が確認できています．
promotorも同じです．
sequeneも確認したところ、問題なさそうです．
現在、宿主の問題と考えてまして、宿主としてDH5a を使用していますが、BL21(DE3)二変更しようと考えていますが、適切でしょうか？
もし、何かいいアドバイスありましたら教えてください．

回答No.4

pi3-kinase

プロテアーゼが原因であっても、トランスフォームによってタンパク質が大量に発現しているのであれば、どこかにでっかいバンドが見えると思いますが、そのようなものも見られないのですか？私も分解を受けるタンパク質を発現させた事がありますが、低分子量のところにボテッとバンドが見えましたが、どうでしょうか？他に確認、及び試してみるなら、
　(1)プロテアーゼ欠損BL21株などを試す
　(2)トランスフォームし直す(抗生物質を新たに調整して）
　(3)シークエンスはしてみましたか？
　(4)必要であれば、IPTG誘導は行っていますか？
　(5)ベクターはpGEXシリーズですか？そうであればBL21で問題ないはず　　ですが・・・
　(6)もし、プロテアーゼによる分解が認められるのであれば、低温培養　　するという方法が有効な場合があります。
と、私が考えられるのはこれくらいですが、確認してもらえますでしょうか？

回答No.3

pi3-kinase

普通、目的タンパク質発現ベクターをトランスフォームした大腸菌を大量に培養して、超音波処理等によって溶菌し、遠心分離後得た可溶性画分中から目的タンパク質を精製しますよね？タンパク質によっては、可溶化せずに、不溶性画分にいってしまう場合があります(インクルージョンボディを形成するなどして・・・)。一度、遠心分離した沈降物をWB or クマジー染色するなどして、目的タンパク質の有無を確認したことはありますか？

補足

ご指摘もよびご指導大変ありがとうございます．　超音波処理によって溶菌し、大腸菌全体、不溶性画分、それぞれについて、WBおよびCBB stainしてみましたが、確認できませんでした．
コンピテントセル中のプロテアーゼが原因かなと思い始めていますが、この考えは正しいのでしょうか？
何かアドバイスありましたらよろしくお願いします．

回答No.2

pi3-kinase

インクルージョンボディにいってるっていう事ではないでしょうか？

補足

インクルージョンボディとは、大腸菌の部位の名前なのですか？それとも、タンパク質の構造が違うものなのでしょうか？

インクルージョンボディではWestern blottingでは検出されないのでしょうか？

回答No.1

ga111

BL21(DE3)は、T7のプロモーターをもつものに一般には使われるので、あまり適切ではないでしょう。ただ、lacI遺伝子があるので、コロニーが生えてくれば、試してみるのはいいかも。

T7のプロモーターにかえるか、GST、MBP融合蛋白でいくのがいいです。融合蛋白ですとGSTの高い翻訳効率が反映されやすいからです。

参考URL：

http://www.cosmobio.co.jp/technical/tech_NVG_20040518/tech_NVG-1-H_20040518.asp

補足

丁寧な回答ありがとうございます．
参考URLも非常に参考になりました．

DE3のない、ただのBL21を使用してtac promotor 下流のgeneからタンパク質発現を考えましたがどうでしょうか？