タンパク質濃度測定法について

質問

いつもお世話になります。
タンパク質濃度測定法について質問させてください。
測定するタンパク質はウサギ肝臓ホモジネートより遠心分画法で分離した粗ミトコンドリア分画です。
今までSDS-PAGEのための濃度測定にBCA法を使っていました。
泳動にも問題はありませんでした。
BCAはビアスのキットを使っています。
タンパク標準液も市販のものです。
今回、濃度が濃そうだったのでビウレット法でも試してみたところ、BCA法で31.69ug/ulだったサンプルがビウレット法では121.5ug/ulになってしまいました。
検量線は両方ともリニアにひけています。
タンパクも両試薬ともアルカリ性ですし、きちんと溶けているように思えるのですが・・・
原因が思い当たる方、そしてどちらが信用がおけるかアドバイスお願いします。

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

私自身はBradford法のキットを使っているので参考になるかわかりませんが、

おそらくタンパク質標準液はBSAを使っていると思いますが、
BSAはbradford法では測定濃度が濃く出てきてしまうのでスタンダードとしては不向きといわれています。
もしかしたらbiuret法とBCA法のどちらかまたは両方がその影響を受けている可能性があるのではないでしょうか。

どちらかというと私は以下の方が原因だと思っていますが、
改良型のキットを使っていると影響が無いかもしれませんが、
界面活性剤、塩、還元剤などの影響を受けているために違いがでているのではないでしょうか。

具体的な条件やbufferの組成がわからないのでどちらが正しいとはわかりませんが、
lysis bufferにEDTAが入っているのならばCu2+に影響しているような気もしますが。

タンパク質標準液の希釈には終濃度が同じになるようにlysis bufferを入れているのでしょうか。
それである程度は回避できると思います。
そうでないとスタンダードがリニアになっていても底上げされていて濃度が違う結果になることがあります。

お礼

BSAが適したスタンダードかどうかわからないのですね。
lysis bufferはEDTA抜きのものでタンパクwashしていますが、最初に入れているので影響があるかもしれません。
その方向で試してみます。
回答ありがとうございました！