SELEX

質問

ＤＮＡ(ＲＮＡ)アプタマーを効率的に得る手法としてSELEXというものがあるということを知りました。このSELEXという手法では「指数関数的に」特定のアプタマーを選出することができるとあるのですがどうしてでしょうか？セレクション系とＰＣＲとの相乗効果と考えてよいのでしょうか？
また、ＳＥＬＥＸ法でははじめにＤＮＡライブラリーを作製しなければならないのですが、１０つの塩基配列ランダムに作製しようとしただけでもその種類は莫大な数(４の１０乗)になり、ライブラリをつくるだけでも大変時間がかかりなのですが、これはＤＮＡはひとつづつ合成するのでしょうか？
参考文献でもよいのでどなたかご教授ください。

回答No.4

geneticist12 · ベストアンサー

>ＰＣＲの話のところで、プライマーには片方は同じ配列、他方は相補配列を用いるとあるのですが、これだとアニーリングの時に片方のプライマーしか鋳型ＤＮＡに結合しないのではないでしょうか？

PCRの最初の伸長反応のときは3'側のプライマーしか働きませんが、2回目以降は新たに合成されたDNA鎖も鋳型になるので、両方のプライマーから伸長反応が起こります。

補足

両方相補的なプライマーだとＤＮＡの増幅ができないですよね。すいません、かんちがいしていました。
丁寧な回答ありがとうございました。疑問がとけました。

回答No.3

geneticist12

>二本鎖でスタートするとあるのですが、一本鎖だとなにか不都合なことがあるのでしょうか？

ふつうDNA結合タンパク質は特定の配列をもつ二本鎖DNAを認識するものですから。ごく特殊な目的で一本鎖DNAを使うことがあるのかもしれませんが。
RNA polでRNAを作ってRNA結合タンパク質を取り扱うときも、鋳型DNAは二本鎖でなければなりませんからね。

5'(primer sequence)NNNNNNNNNNNNNNNNNN(primer annealing sequence)3'
やっぱりわかりにくかったですね。
末端に固定配列をもつランダムoligo DNAをPCRにかけるなら、片方のプライマーはoligo DNAの5'末端と同じ配列、もう片方はoligo DNAの3'側末端の相補配列になりますね。
たとえば、oligo DNAがこんな配列なら（デタラメですが）
5'(AAAGGGGTTCC)NNNNNNNNNNNNNNNNNN(aaccctttggt)3'
なら、プライマー自体の配列は、
5'-AAAGGGGTTCC-3'　と　3'-TTGGGAAACCA-5'

補足

回答ありがとうございます。
２本鎖にする理由がよく分かりました。

ＰＣＲの話のところで、プライマーには片方は同じ配列、他方は相補配列を用いるとあるのですが、これだとアニーリングの時に片方のプライマーしか鋳型ＤＮＡに結合しないのではないでしょうか？
質問ばかりですみません。

回答No.2

geneticist12

逆でした↓
5'(primer sequence)NNNNNNNNNNNNNNNNNN(primer annealing sequence)3'

回答No.1

geneticist12

DNAのプールは、通常のoligo DNA合成一回分でできます。通常は一塩基伸ばすごとに、一種類の塩基を加えていきますが、このときに複数の塩基を加えれば、たとえばC or G とかA, C, G or Tという産物を作ることができます。合成をオーダーするときに、
5'(primer annealing sequence)NNNNNNNNNNNNNNNNNN(primer sequence)3'
のようにランダムにする塩基をNで指定してやればいいのです。ふつう、ランダムにすることによる追加料金はないです。
二本鎖DNAでセレクションをかけるときは、まず合成した一本鎖DNAをPCRで増幅すると同時に二本鎖にしたものからスタートします。一本鎖RNAの場合は、primer annealing sequenceの部分をT7プロモーターの配列にしておいて、T7 polymerase でRNAにするようです。

たとえば、ある結合タンパク質にくっつく配列を探すときには、ランダム配列のプールから、カラムやゲルシフトなどで、そのタンパク質に結合した分画をとり、それを（RNAの場合はcDNAにして）PCRで増やし、それをまた（RNAの場合はT7 polでRNAにして）フラクションするということを数回繰り返します。最終的にはPCR産物をクローニングして結合する配列を明らかにします。

補足

回答ありがとうございます。
>このときに複数の塩基を加えれば、たとえばC or G とかA, C, G or Tという産物を作ることができます。
同時に複数の塩基を加えればランダムな配列ができるの、一つ一つ合成しなくてもよいのですね。納得しました。
ここまでは理解できたのですが、その後が専門知識が乏しいのでよく分かりません。
ＤＮＡでセレクションをする場合、二本鎖でスタートするとあるのですが、一本鎖だとなにか不都合なことがあるのでしょうか？
あと、プライマーは分かるのですが、アニーリングのもとそうでないものではどう違うのでしょうか？
お時間があれば、回答お願いします。