共焦点レーザー顕微鏡

質問

共焦点顕微鏡で植物組織（クロロフィル蛍光）
の観察をしています。
原理的には、切片が厚くても
任意の深度に焦点を合わせられる筈
だと思うのですが、
実際にやってみると、かなり薄い切片を
作らないと、きれいな画像が得られません。
これはどうしてなのでしょうか？

回答No.4

gerbil_kyusyu · ベストアンサー

補足です。
生試料で無ければならないのでしょうか？
固定処理をして、通常の脱水、キシレン、バルサム封入だけでも、透過性はかなり上がると思います。
クロロフィルの自家蛍光は残ると思いますよ。

一方、生でなければならない理由があるようでしたら、表面の情報のみを使うと割りきった方がいいかもしれません。厚切り切片であっても、落射型蛍光顕微鏡の特徴から、表面から数ミクロンまでであればきれいなデータは取れる可能性が高いと思います。どこまで行けるかは、Zセクショニングして検討してみてはどうでしょう。

お礼

補足回答ありがとうございました。
生でなくてはならない理由は、
（固定、脱水、封入したサンプルでも
　自家蛍光が残ることを知りませんでしたので）、
とにかくすぐにデータが欲しかったからです。。。
同時にTEM用のEPON包埋試料も作成して
おりますが、それでもクロロフィルの蛍光は
観察できるのでしょうか？

次回から、Zセクショニングで最表面のスキャンを
試みてみたいと思います。
ありがとうございました。

回答No.3

TCA

＃２です。書き忘れたことがありました。
安息香酸ベンジルとベンジルアルコールを１：１の割合で混合したものは水と混ざりません。もしお使いになるのでしたら、バルサムなどで封入する時と同じ要領で、サンプルをエタノール脱水する必要があります。
また、脂溶性の高いものはこの溶液に溶け出してしまいます。もしかするとクロロフィルも溶け出してしまうかもしれません。

お礼

補足回答ありがとうございました。
参考にさせていただきます。

回答No.2

TCA

厚手で透明ではないのサンプルの場合、レーザー光や励起されて生じた蛍光が乱反射で弱くなってしまうようです。動物組織を免疫染色したものなどでは、安息香酸ベンジルとベンジルアルコールを１：１の割合で混合したものに浸けて透明度を上げてから観察していました。

お礼

とても参考になりました。
植物（針葉樹）の葉を輪切りにしたものを観察しているのですが、
透明ではないもので、かなり薄く切らないときれいな画像は得られません。
透過処理ができると良いのですが。

回答、ありがとうございました。

回答No.1

gerbil_kyusyu

共焦点でも厚手の試料場合、光の乱反射が原因になるかもしれません。原理的には、データ採取は試料中を光が直進する場合を想定しています。しかしそうならない場合は、理論的によい像を得ることはできません。その場合は何らかの透過処理をする必要があると思います。

ただ、私自身、植物で厚手の生の資料を観察したことはありませんので、的はずれかもしれません。あしからず。。

お礼

光の乱反射が原因だったのですね。
生の植物のクロロフィル蛍光を観察しているので、透過処理はできないと思います。
やはり、きれいに薄切りにするしかないようですね。
回答、どうもありがとうございました。