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immunoscreeningの発色
λTripleExのファージライブラリーを用い、抗体を使ったimmunoscreeningをしています。IPTGでタンパク誘導し、NBT/BCIPで発色させています。 実は発色にかなりばらつきがあり、陽性と陰性のプラークの区別が付き難いときが多いです。こんなものかと思う反面、非常に明瞭に判別が付くこともあり、困っています。 プロトコルはマニュアルに沿ってやっているのですが。ちなみに1次抗体は人の血清を使っています。
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プラークのブロットの具合、培地によるメンブレンの汚れ具合、溶菌のさせ方などによって、シグナルの強さや、S/Nがばらついたりしますね。スメアになるのは、こすれたり、溶菌のときに液が多すぎて流れたりしたときになどに起こります。 それと、抗体反応のときの液のあたり具合が影響します。何枚ものメンブレンを同時にインキュベートしたりすると、重なり具合で仕上がりがずいぶんばらつきます。 それと、アルカリフォスファターゼは感度が高いのですが、バックグラウンドも出やすいです。一つには、大腸菌の内在性の酵素が効いてきますし、NBT/BCIPも長時間の反応では、ごく低いノイズにも（ノイズすらないところでも）発色してしまいます。感度は一桁くらい落ちますが、パーオキシダーゼで検出したほうがS/Nはいいかもしれません（発色ではなくルミノール発光を使えば、感度はあがります）。 蛇足ですが、＃1さんの大腸菌ライセート云々は、大腸菌で発現させたたんぱく質で免疫した抗体を使う場合です。大腸菌そのもののたんぱく質に対する抗体もできていて、すべての大腸菌と反応してしまう場合のことです。
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- geneticist12
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>パーオキシダーゼで発光というのは?何かいい本がありますでしょうか? アマシャムのECLシステムが、古くから使われていて、今でも廃れずに残っているので、信頼性が高いと思います。
お礼
どうも有り難うございます。 やってみる価値がありそうです。 HRP標識の抗体を買ってやってみます。
- meineko
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陰性のプラークも染まってしまい、陽性との差が少ないということでしょうか？ それとも、陽性の方も弱くしか出ないということでしょうか？ 前者なら、ブロッキングやwashの条件を工夫して、陰性のプラークに色が出ない様な条件を見つけてみてはどうでしょうか？ あと、抗体はどのようにして作られたものですか？大腸菌で発現させた抗原を元に作った抗体などで、時々、大腸菌のタンパク質とも反応してしまうものがあります。そういう時は、ブロッキングの時に大腸菌のラーセートを加えてやると、バックグラウンドを減らせます。 後者の場合、培養時間等の条件を変えてみると、発現量が稼げるかもしれません。 とりあえず、不確かなプラークまでみんな拾って、二次スクリーニングを行うというのも、手かもしれません。
お礼
有り難うございます。 参考になりました。
補足
どうも有り難うございます。いくつか重ねて質問させてください。 陽性との差が少ないのです。マニュアル通り、ブロッキングはTBST+ゼラチン1%、washはTBSTで行っているのです。 大腸菌のラーセートを加える、というのは具体的にはどうするのですか?一晩液体培地で培養し、10mMMgSO4でストックしてある大腸菌(ファージに感染させるのに使うやつですね)を一次抗体とのインキュベートの時に加えるということでしょうか。 不確かなプラークも含めて拾いたい、のですが、発色後にメンブレンを引き上げると、何だかプラークの周りにしっかり円周上に色が付いているのではなくて、ぼやぼやっといくつかのプラークにまたがってスメアのように見えるときもあります(説明が難しいのですが)。そういうようなときはありますか?
補足
どうも有り難うございます。 メンブレンを同時にインキュベートするのは確かにいけないことだとは思っているのですが…あまり少ない枚数だと液や抗体がもったいないしと思ってしまいます。皆さんどうされているのでしょうか? パーオキシダーゼで発光というのは?何かいい本がありますでしょうか? 大腸菌ラーセートの部分はおかげで理解できました。私は人の血清由来の抗体を使っているので関係ないですね。