プロモーター領域

質問

ある既知のタンパク質遺伝子のプロモーター領域の配列を知りたいというときにはどのように検索すればよろしいのでしょうか。
タンパク質そのものの配列までは調べられたのですが…その後がよくわからなくて。

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

実験的に同定するのは結構手間です。
まず、転写開始点を正確に決めておく必要があります。
簡便には、5' RACEの産物の端がどこにきてるかで見てもいいと思いますが、完全に伸びきっていない逆転写産物もPCRで増やしてしまうので、多少のあいまいさがでてきます。
正確に決めるには昔ながらのprimer extensionやS1 mappingが必要でしょう。
で、プロモーターは（発現をmodulateするエンハンサーは話が別です）、典型的には転写開始点の-50 bp以内にあります。たとえば、真核生物では、-20 bp 前後にTATA boxまたはGC box、さらに-15 bp くらい上流に-CAATboxとか。そういう典型的な配列があれば、8割がたそこがプロモーターだという蓋然性を言うことができます（かならずしも典型的なプロモーターばかりではありませんが）。
ちゃんと実験的に証明しようとしたら、候補となる領域にレポーター遺伝子をつないで、in vitroやin vivoで転写活性を調べなければならないでしょう。システマティックに欠失シリーズや、点突然変異を作って、どの配列がプロモーター活性に必要十分であるかを明らかにすれば完璧です。

お礼

丁寧なご回答有り難うございます。
やはりきちっとやるには片手間ではできないものですね。
上司もよくわかっていないと思います。
また質問することもあるかもしれません。

回答No.4

methyl

#1です。
既に回答がありますように、ちょっと興味があるというくらいでやるには結構しんどいです。しかも、発現との相関を探されてるのでしたら、転写開始点直上流のいわゆる典型的なプロモーターというよりも、さらに広い意味で探したいということなのですよね？もし、そういう状況で何か情報を手に入れなければならなくなったら、私ならとりあえずある程度近い種類の動物間（マウスならラット、ヒトなど）で上流領域の配列比較をやりますかねえ。上流3kbpくらいの配列を持ってきてアプリを使って相同性をプロットして、相同性のあるところを改めてmotif検索するくらいでしょうか。あとはNCBIでSNPを探したり。。
結局はあくまでも候補で、mutation→promoter assayなどをやらないと結論はでませんが。。

お礼

有り難うございます。
ちょっと軽く考えすぎていました。
また勉強の上お聞きすることもあるかと思います。

回答No.2

geneticist12

Genbank
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide
DDBJ
http://srs.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html
などで、その遺伝子を含むゲノムDNAの配列情報を見てください。もし、プロモーター配列が同定、または予測されていれば、Annotationのなかに記載があるはずです。
しかし、実際にプロモーターや転写開始点を同定するのは労力を要するし、かならずしもすべての研究者が重要視して調査するわけではないので、そういう情報がある遺伝子のほうがむしろ少数派でしょう。たいていは、cDNAの情報、翻訳領域の情報どまりだと思ってください。
そういう時は、その遺伝子の上流領域のゲノムDNA配列をデータベースから取得して、プロモーター予測プログラムにかけてみるのも手でしょう。
たとえば、
http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=index&group=programs&subgroup=promoter

http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCHJ.html

お礼

早速のお返事有り難うございます。
Genbankのサイトでは見ましたが、プロモーターがどこかといった情報はなさそうです。
実を言うとあるタンパク質のexon周辺のSNPを探し、intron内にいくつか発見はしたのですが、それだけでは寂しいので発現に影響しているかを考えるのであればプロモーター領域にSNPが無いか探してみるのはどうかと上司に言われたわけです。
回答していただいたとおり、exonの上流域の配列をコピーして例の予測プログラムに入れたところ、
「Length of sequence- 1620
Threshold for LDF- 4.00
1 promoter(s) were predicted
Pos; 241 LDF- 5.73 TATA box predicted at 211
Transcription factor binding sites:
for promoter at position - 241」
と出てきましたが、これは一つ考えられるところがあると言うことだと思うのですが、ただ、予測プログラムと言うことはこれが実際にそうか、と言うこととは別ですよね?
一般的にプロモーター領域の同定というのはどのようにされるのでしょうか?

回答No.1

methyl

プロモーターはタンパクによって異なります。TATA配列やCpGアイランドなど手がかりとなるものはありますが、結局決定するにはmutationを入れたりpromoter assayなどをしなければなりません。なので、既知のタンパクであるならPubmedで検索してみてはいかがでしょうか？

お礼

有り難うございます。
タンパク質のプロモーター領域を知るには実際にはどのような手順を踏むのが一般的なのでしょうか?
もし良い文献や参考書などがあったら教えていただけないでしょうか。