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クラミドモナスのcDNAライブラリーの作成
緑藻クラミドモナスのcDNAライブラリーを作成しようと思い、羊土社の遺伝子工学実験ノート上を参考にして操作を行なったところ1stストランドの段階で逆転写反応がうまくいっていないようです。クラミドモナスのmRNAはGCリッチで高次構造をとりやすいのでそういったことも関係しているかもしれません。どなたかこのような問題を解決するよい方法やクラミドモナスのcDNAライブラリーはこのように作ったらいいなどのアドバイスがありましたら教えてください。お願いします。
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クラミドモナスを扱った経験が無いので、あくまで一般論としてお聞きください。私はマウスやヒトのGC-rich領域を解析対象にすることが多いのですが、高次構造を避けるためには様々な添加試薬（グリセロールやベタイン、DMSO等、検索してみるといろいろ書かれていると思います）を加えることが有ります。ただ、これらの主目的としては二次構造をくずし、例えばPCR productのTm値を下げることにあります。そのため、単純にRT反応の温度を上げるなどで解決できるかもしれません．ただ、最初に書きました通りマウス等が専門で、RT反応に添加試薬を入れたり温度を変えたりしたことはありません。ですので、あくまでもご参考程度になればよいのですが。。 あ、あとRT反応も含めKitを使う際は実験本よりも付属のマニュアルを参考にされた方がいいと思いますよ。
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- geneticist12
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補足します。 たとえば、インビトロジェン（旧 BRL）で販売している逆転写酵素で、SuperScriptIIIであれば50度、ThermoScriptなら70度で反応できます。もちろん、RNAの2次構造を回避することを主目的に開発されたのもです。
お礼
ありがとうございます。目的に合わせた酵素を選ぶことも大事ですよね。いろいろ検討していきたいと思います。
お礼
さっそく回答していただき、ありがとうございます。なるほど、温度が大事なんですね。使ってる酵素の説明書をみるとRT反応の温度をもうすこしあげてもだいじょううぶそうなので検討してみます。あと高次構造を回避する試薬も検索してみます。ありがとうございました。