μm単位の生物の分離法について

質問

研究でクラミドモナスとゴニウム、パンドリナを扱うようになったのですが、この3種類が同じ容器に入っていて、比較しながら実験したいので、この3種(各8μm、24μm、20μm)を個別に分けようとしてみたのです。ところがどうもうまくいきません。フィルターがサイズに合うものがなくて、遠心分離なども試して見たのですが、思うようにはいきませんでした。ピペットで顕微鏡を見ながら分けようとしたのですが、それもうまくいきませんでした。(やり方にまずいところがあるかもしれませんが...)

何か良い方法はないでしょうか？

知っている方おられたら、教えてください。

回答No.5

protozoa · ベストアンサー

再び、protozoaでございます。

すいません、桁まちがえてました。確かに1/50mmでは、肉眼では厳しいかもしれませんね。

実験の目的を考えるに都度分離するよりも、系統を確立した方がよいでしょうから、単離培養した方がよいと思います。そこで、下記の方法は如何でしょう。

その1
もし、対象がクローナルエイジングで、運動性がそれほどないなら、希釈してから寒天培地にまいてコロニーを形成させてみるとか(大腸菌じゃないから無理ですか)。

その2(その1の変形)
1. 最初の培養液で、3種入り混じった大雑把な個体数を数えます(100個体/mlとか)。
2. 1個体/1mlぐらいになるまで希釈します(上記の場合は100倍希釈)。
3. 上記希釈液をエッペンドルフチューブなんかに1mlほど分注して、それを100本作ります。
4. それを、しばらく培養。
5. うまく行けば、100本中の何本かは、単離できてるのではないでしょうか。

希釈倍率とサンプルの数は、あなたの経験とカンと熱意により、適当に調整してください。

その3(力技)
下記の「教材としての原生動物」という報文には、マイクロピペットでつり出せとあります。
一度につり出しは難しいから、シャーレに順番に移して次々と希釈していけとあります(そう言えば、昔そんなこともやりましたか)。

http://wwwsoc.nii.ac.jp/jsproto/journal/jjp36/jjp_j.html

その4(他力本願)
すでに単離培養済みの株をどこかから譲り受ける。

その1は論外として、その2とその3をアレンジすれば、なんとかなりそうな感じがします(結局は、修行しだいですかね。無責任で申し訳ないですが、何とかなると思いますよ)。

うまく行くことをお祈りいたします。

お礼

protozoaさん、どうもありがとうございます。

何とかなりそうな気がしてきました。

とりあえず'その2'、'その3'で頑張ってみたいと思います。

回答No.4

kgu-2

No2のkoumoriyaさんが書かれているのは、フローサイトメーターのことかと。
　細胞をサイズで分類しますが、(各8μm、24μm、20μm)では、しんどいかも。それに、高価格です。病院だと、検査部にあるかもしれませんが、血液以外のものに使わせてくれるとは思えません。

参考URL：

http://www.fujisawa.co.jp/reagent/market_0310/oncomark.html

回答No.3

protozoa

今ひとつ分離を行う目的が分からないので、以下、適当に書きます。
おそらく、別々に分離して培養と言うわけには行かない実験なんでしょうね。

分離の目的が単に数を数えるだけなら、形が壊れないか見分けがつく方法で固定して、トーマの血球計算板で、赤血球やら白血球を数える要領で数を数えます。

生きているものを、少数分離したいなら、
僕でしたら、1/5mm程度ですから目に見えない訳ではないですし、三者の泳ぎ方の特徴を見分けた上で、先を細くしたパスツールピペットで金魚すくいします。
難しければ、ホールスライドなどに培養液を少量とって、実体顕微鏡かルーペで覗きながら金魚すくいします(数が多すぎてすくえない場合は、適当に希釈しましょう)。
これは、修行しだいですね。僕は、アメーバ・ゾウリムシ・ミドリムシを、上記の方法で分離した経験があります。
動きが速いようなら、メチルセルロースで動きを遅くするとか。

生きているものを大量に分離したいなら、走性などの生態の違いから大雑把に分離して、はぐれものをピペットで除くなど。

どんな目的で分離するのか、対象の生死は問うのか、どの程度の規模で分離したいのかが分かれば、もっとよい方法も浮かぶやもしれません。

以上、ご参考になれば幸いです。

補足

ご回答ありがとうございます。
参考にさせていだだきます。

目的ですが、これら3種はボルボックス目の動物で、それぞれクラミドモナス様の細胞からなっています。

テーマは単細胞生物から多細胞生物への分化についてということで、実験をしています。

そこでゴニウム(8個)やパンドリナ(8個)をバラバラにしてから、また元に戻すというようなことができないかという実験をしてみたいのです。20μmだから、1/50mmですね。

それで、個別に分けれたほうが、観察しやすいので分離したいのです。だから、生きたままできるのが望ましいです。最終的には3種別々に培養したいのですが・・・

回答No.2

noname#11481

人の血液検査器械で自動血球計算器というのがあります。詳しい構造はわかりませんが、たぶん細い場所を通してそこを通る血球をカウントしているんだと思います。大きさの設定が可変なら使えるかなあと思いますが。でも、器械自体が１００万円を超えます。
モニターで借りてくるか・・・・。

お礼

koumoriyaさん

ありがとうございます。

器械は医学部とかにあったりするのかなぁ？

参考にしてみます。

回答No.1

anakujira

それらの生物については，全く知識がありませんが，
密度濃度勾配で分離はできないでしょうか。

補足

それは密度濃度勾配の遠心分離ということでしょうか？

何度か、ショ糖で濃度勾配を作って遠心分離にかけてみたのですが、どうもそれらしき結果がえられませんでした。

精度を上げるには、濃度勾配を多く作ればいいんでしたっけ？