PCA法

質問

今、ゼミでPCA法を用いて実験を行っているんですが、感作なしのグループと感作ありのグループとの吸光度の差がまったくありません。しかも、測定時の溶液の中には、浮遊物があるものもあり、吸光度が測れないものもあります。この二つが原因で実験がうまくいきません。何か解決方法があれば教えてください。

ちなみに実験方法は以下の通りです。

(1)マウスの両耳介にDNP-IgEを1000倍希釈したものを10μｌずつ皮内投与する。
(2)(1)の48時間後、尾静脈内にエバンスブルーとともに1
mg/mlのDNP-BSAを0.25ml投与し、アレルギー反応を誘発させる。
(3)(2)の30分後、頚椎脱臼によりマウスを屠殺し、両耳を切り取り、0.5mlの1N水酸化カリウムに片耳ずつ浸し、37℃で一晩放置する。
(4)2.5Nリン酸：アセトン＝3:17の混合液2mlを加え、3000rpmで10分遠心分離する。
(5)溶液の上清をパスツールピペットでとり、620nmで吸光度を測定。

水酸化カリウムに溶けきらないものもあります。
抗体を入れたものでも、耳に青色の点ができないものもあります。また逆に、抗体を入れてないのに、点ができるものもあります。

回答No.2

oolong_tea13

こんにちは．

エバンスブルー抽出時のリン酸とアセトンの調製は，一度ご検討ください．

i.v.後，マウスの体が青くなっていることから惹起の手技（i.v.）はOKだと思います．
しかし，感作時に投与液が少し漏れた懸念があるということは，感作されていない可能性が濃厚（i.s.ミス）のように思いますので，調製よりもこちらの対応を優先された方がよろしいかもしれません．

マウスのi.s.はやさしくありませんので，可能であれば投与の練習をお勧めいたします．
PCAで用いる動物には他にもラットやモルがありますが，それらよりも圧倒的に皮膚が薄く，しかも針先で割けやすいため，細心の注意が必要です．

i.s.時のコツとしては，針を1cmくらい挿入して薬液注入後，5秒ほど針を動かさずに保持した後に，シリンジを回転させながら針を抜いてみてください．

おそらく動物については，文献などを模倣されていると思いますが，BALB/cの5Wで♀となると，相当小さいと思います．
ウチの会社では通常♂しか使いませんが，大きさとしてはICRやddYの7～8Wが手頃かもしれません．週齡については，大きくなりすぎると免疫学的応答が鈍感になるので10Wくらいが妥当だと思います．

投与手技（一例）の英略を載せておきます．せっかくの機会ですから何の省略かお調べになるのもいいかもしれません．
p.o.：経口投与
i.v.：静脈内投与
i.p.：腹腔内投与
s.c.：皮下投与
i.s.：皮内投与

また何か不明な点等ありましたら，質問してください．

回答No.1

oolong_tea13

こんにちは．
マウスの耳介でPCAですか．
マウスの耳介を使う試験といったら，
DNFBなどの累積投与が最初に頭に浮かんだのですが，
テクニック的にはなかなか難しいものを行っていますね．
文献を参考にされているのでしょうか．

ささいなことですが，エバンスブルー定量時で気になったことがあります．
念のため，エバンスブルー定量時につきまして，
ウチの会社との違いを挙げてみましたので，参考にしてみてください．
（ご相談内容→当社プロトコール）

1.1N-KOH 0.5mLに片耳ずつ浸し，37℃でオーバーナイト．
　→1N-KOH 0.5mLに片耳ずつ浸し，37℃で24hrインキュベート．
2.2.5Nリン酸：アセトン=3:17混合液
　→0.2mol/L(0.6N)リン酸：アセトン=1:13混合液

1.は大きくかわらないかもしれませんが，2.は検討の余地があると思います．

しかし，そもそも青いエバンスブルーの色が出ないことの方が問題ですね．
実験方法からいくつか確認したいことがありますが，
私も勉強したいため可能な範囲で考察してみてください．

1.実験開始時のマウスの系統及び週齡．
2.DNP-IgEを感作に用いていますが，市販品ですか？
3.もしIgEをご自分で作製されたのであれば，IgEができたことをどのように証明しますか（IgGをどのように否定しますか）？
4.DNP-IgEを1000倍希釈したとのことですが，希釈倍率の根拠は？
5.感作液10μLをi.s.とありますが，DNP-IgEの濃度は？
6.感作時の投与ミスの可能性はありませんか（i.s.後に針穴からにじみ出てきた，あるいはs.c.になってしまった）？
7.惹起時にエバンスブルーとDNP-BSAを投与されていますが，1mg/mLとはいつの時点での濃度でしょうか？
8.エバンスブルーと惹起液をi.v.する際，投与の順番は正しい順番ですか？それとも混液を投与していますか？
9.エバンスブルーi.v.後，頸椎脱臼するまでのマウスは体中青くなっていますか？
10.あり得ないとは思いますが，感作と惹起で別々のものを使用してはいませんよね？

なお，感作時にSalineを投与したControlでも青い点ができてしまうのは全く問題ありません．
これは針穴ですから，動物種をラットやモルモットを使用しても完全に0には出来ません．
ですから，PCAに限らずControlの重要性がわかると思います．

長くなってしまいましたが，参考にしてみてください．

補足

ご回答ありがとうございます。
2.5Nリン酸：アセトン=3:17混合液
　→0.2mol/L(0.6N)リン酸：アセトン=1:13混合液
これは大きいと思いました。きちんと抽出できていなかったのかもしれません。

1.実験開始時のマウスはBALB/c雌５週齢です。
2.DNP-IgEは市販品です。
3.
4.DNP-IgEを1000倍希釈は、予備実験を行いました。(1000,4000,8000倍)
5.感作液10μLをi.s.とありますが，DNP-IgEの濃度は？
6.感作時の投与ミスの可能性はにじみでてたはありえるとおもいます。
　s.c.はどういう意味ですか？
7.1mg/mLとは投与時の濃度です。
8.混液を投与しています。
9.頸椎脱臼するまでのマウスは体中青くなっています。
10.ないと思います。市販品を使用していますので。