ウェスタンブロットについて

質問

ウエスタンの発色について教えていただきたいです。
二次抗体にはHRPが結合したものを用いています。
最終的には酸化クロルナフトールが発色するようなのですが、
HRPは過酸化水素を酸化して酸素にし、その時発生した酸素でクロルナフトールを酸化クロルナフトールにし、発色すると聞きました。
すると、酸化クロルナフトールは、二次抗体に結合するものなのですか？？
ただ、クロルナフトールが酸化されるだけだと、抗体の部分だけが発色するという結果が理解できなかったのですが・・・

回答No.2

otx

膜状に沈着するのではないです。
アルカリフォスファターゼの例をあげてましたが、御覧になりましたか？

二次抗体が存在するところでだけ、基質が変化するのは納得ですね？
その変化した基質がウエスタンのメンブレンに沈着するようになるのです。
基質は変化すると何らかの「色」がつき、かつウエスタンのメンブレンに沈着する、ということなのです。結果、バンドとして観察できるということになります。

お礼

なるほど！
とても良く分かりました！！
ありがとうございました。

回答No.1

otx

ウエスタンの発色の一般論を述べたいと思います。

通常、HRPやAPなどの酵素で基質が変化すると、
その基質がメンブレン上に「沈着」していきます。

クロルナフトールを酸化クロルナフトールという物質については、申し訳ありませんが詳しくないですが、
典型的なものは、アルカリフォスファターゼとNBTの関係です。
https://www.nacalai.co.jp/toriatukai/pdf/330-332.pdf

二次抗体に結合というより、メンブレン上に沈着するということだと思います。

それで、発色中はメンブレンを「静止」させて置くことが重要で、
動かすとシグナルがぼやけたりする原因です。

補足

御回答ありがとうございます。
膜状に沈着する、ということですが、ただ単に沈着するだけなら、膜全体が発色してしまうということにはならないのでしょうか？？
目的タンパクのみが発色するということは、変化した基質が、二次抗体を目印にして沈着しているとしか考えにくいと思うのですが・・・