蛋白

質問

ほんとに素人の質問で申し訳ないのですが、、、
細胞表面マーカーをコードする遺伝子をクローニングし、リコンビナント蛋白として発現させ、この蛋白に対するモノクローナル抗体を作成したいのですが、その遺伝子はIgf１rで、4987bp（mRNA),翻訳領域は29～4177とサイズが大きいのです。だから遺伝子の一部をPCRでクローニングしたいのですが、その遺伝子のコードする蛋白が、細胞表面に位置する部分でないと抗体が結合できませんよね！？
そこで質問です。遺伝子のどの部分をクローニングしたらよいでしょうか？ポイントを教えてください

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

それなりに研究されているタンパク質なら、NCBIやSwissplotなどのデータベースで検索してannotationをみたらドメインの説明が付いていると思います。

または、原著論文をおって記載を探すとか。

ぜんぜんそういう情報がないときは、アミノ酸配列から膜貫通、細胞外、細胞内、の各ドメインを予測するプログラムがいろいろありますので、それにかけてみるとか。

もちろん、タンパク質のドメインがわかればそれに対応する塩基配列もわかりますね。

抗原にするならあまり小さくしすぎない方がいいと思います。どんなアミノ酸配列でも同じように抗原性をもつというわけではないですから、抗原性の弱い配列しか含まないものを作ってもいい結果はのぞめません。

また、膜タンパク質という事なので、プロセッシング（たとえばシグナルペプチドの切断）や糖鎖修飾がある可能性があります。シグナルペプチドに対する抗体ができても、生体内の目的タンパク質には反応しないでしょう。また、異種の細胞で発現させたリコンビナントタンパク質は、もとの糖鎖修飾を再現しないと考えたほうがよく、そういうところに対する抗体ができたとしても、実際にはうまく働かないかもしれません。

範囲を絞り込むにはそれなりのノウハウが必要ですので、よくわからないときはなるべく範囲を広く取っておくことです。

お礼

か、かみさま・・・
丁寧な回答、本当にありがとうございました。
周りにきけるひとがいなくてすごく困っていたので感謝感謝です。
がんばって調べてみます

回答No.3

MIYD

てっきりモノクロの作り方のレポートかと思っていました。
本当に使おうとしているんですね。

一応
http://au.expasy.org/cgi-bin/ft_viewer.pl?P08069
にExtracellular (Potentialでですが)のドメインがのっています。
作る前には原著をあたった方がいいと思います。

でも、本当にモノクロが必要な実験なのでしょうか。
昔はモノクロを作るのは一年がかりで、
修士2年間で作って染めて終わりと聞きましたが、
今はもっと早くできるのでしょうか。
その時間を金で買えるのですから、
自腹で買ってもそこまで高くは無いと思いますが‥

全長のポリクロを作って、IHCしてみてからでも遅くは無いと思います。

もし買う羽目になりそうだったら、その前に、
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=7514333&query_hl=6&itool=pubmed_docsum
こちらのラストオーサーにメールしてみてはいかがでしょうか。
http://endo.endojournals.org/cgi/rapidpdf/en.2003-0985v1.pdf
貰っている人がいるようです。

お礼

ありがとぉ～ございます！！
サイトを開いたらほしかったデータがばっちり載っていて嬉しさのあまり踊りだしてしまいました
私はまだ研究されていないイヌとネコで目的の抗体を作るので、ヒトやマウスでのデータをもとに実験は自分で行わなければいけないのです。。。

回答No.1

MIYD

市販を試していないなら買ったら？
http://www.abcam.com/index.html?datasheet=16890&t0=2557417-19419416

http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=searchresults&searchtype=targetantibodies&intProductTypeID=1&strSearchTerms=IGF1%20Receptor

Neutralisingに使えてるし、細胞外の部分も認識しているのでは。

お礼

ありがとうございます
最終手段、自腹で買います、、、