皮膚 凍結切片の作り方

質問

ヘアレスマウスの皮膚凍結切片を作りたいと思っています。調べたり試行錯誤することにより、一応は皮膚の構造がある程度観察できる様にはなったのですが、なかなか綺麗な切片を作ることができません。今、私が従っている大まかなプロトコールと困っている事について書くので何か良いアドバイスがあったらお願い致します。

プロトコール
皮膚採取（脂肪を取ろうとすると真皮を傷つける可能性があるので、脂肪は取らずに引き剥がす様に取っています）→４％パラホルムアルデヒドで一晩固定（そのまま固定すると皮膚が丸まってしまうのでホチキスで大きめな皮膚片を濾紙に張り付けあとで必要な大きさにしてます）→10％ショ糖PBS（一晩）→20%ショ糖PBS（一晩）→30%ショ糖PBS（一晩）→OCTコンパウンドに置換（４℃で４時間程行った物の方が３０分のものに比べ良かった気がします）→ドライアイスアセトンで凍結（空気による冷却むらをなくすために小刻みに揺らしながら）→クリオスタット内で２０分ほど放置し、クリオスタット内の温度と一緒にする→表皮側から刃を入れ薄切りに（-１８℃、厚さ５マイクロｍ）→張り付け→冷風で乾燥→ＰＢＳで水和→染色

困っている点
・皮膚の採取方に自信がありません。
・固定、ショ糖置換により皮膚が薄くなっているように感じるのですが、これで良いのでしょうか？
・薄切りすると、表皮を境に裂けます。一応、これをスライドガラスに付け観察するとちゃんと皮膚がいるのですが高確率でねじれたりしてなかなか綺麗な切片を作れません
・マウスには皮筋という物が存在していると聞いており、確かに真皮の下のあたりにフィラメント状の構造を確認したのですがこれが皮筋ですか？

以上です。まとまりがなく長い文章になってしまってすいません。答えられる範囲で良いので答えてもらえると非常に助かります。

回答No.1

tatoo · ベストアンサー

私は皮膚については詳しくないので、組織切片を作るときの一般論になってしまいますが、書き込んでみます。

まず、２番目の質問ですが、
固定するとたいていの組織は縮みます。ある程度は仕方がないことだと思います。
３番目の質問ですが、
組織切片の作製では、いろいろな固定法、包埋法、切り方がありますが、これらの過程を改良して劇的に改善されることを期待するよりも、
切片の切り方に慣れることが最も綺麗な切片を作る早道である気が個人的にはします。
質問者さんの方法は一般的によくやる方法で、そう間違っているようには思えません。切片の切り方を練習するのがいいと思います。私も一日中クリオスタットの前に座って引きこもりました。
あと、組織の形が見たいだけ、免疫染色がパラフィン切片でも大丈夫であるならば、パラフィン切片のほうが綺麗な組織像を得やすいです。また、個人的にはそちらが切りやすいと思います。
しかし、これにも経験が必要ですよね・・・。一番いいのは経験者を捕まえて教えを乞うことです・・・。

あと、１と４番目の質問ですが、
マウス組織学
著者：多田伸彦（東海大学健康科学部教授）
B5判・上製本・140頁
定価8,820円（本体 8,400円）
という本があります。これはいろいろなマウスの組織の切片像を掲載してあります。ほとんどがパラフィン切片像だった気がしますが、この本と見比べてみてはいかがでしょうか。

お礼

親切なご回答ありがとうございます。

今までどこの段階で組織が壊れてしまっているのか不安だったんですけど、今回プロトコールを見ていただいてある程度あっているみたいなので安心しました。
マウス組織学という本はうちの図書館にあったので早速見比べてみた所、ある程度できているみたいなので、あとはひたすら切る練習をして凍結切片を習得したいと思います。