パラフィン切片について

質問

こんにちは、いつもお世話になってます(^_^)

皮下組織を含む皮膚組織を包埋した
パラフィンブロックを薄切して
3μm厚のパラフィン切片を作製しています。

薄切するところまではいいのですが…、
悩みは次の二つです。
(1)伸展版にスライドグラスを置いて
　30分くらい経って切片を見てみると
　組織のなかに（スライドグラスと切片の間に）
　泡ぶくというか水泡のような盛りあがり
　ができている。

(2)脂肪組織を多く含む大きめの切片は
　伸展版にのせておくと花開くように
　分解して組織がくずれてしまう。

原形を保ったままきちんとスライドグラスに
貼り付けたいです…。
改善できるよい方法をお知りの方、ご教授願います。
ちなみに、
使っているスライドグラスはアルブミンスライドです。
伸展版にのせたあとは十分に水分をろ紙で除いています。
伸展版の温度は45～48度の設定です。
油分が残らないように手はしっかり洗ってから行っています。

回答No.1

sonorin · ベストアンサー

一番考えられる要因は、伸展台の温度が高いことです。温度設定は教科書通りでも、実際の温度が表示温度よりも高い場合があります。
脂肪組織が解離しやすいのもこれが特に大きな要因になります。
乾くのに時間が掛かっても仕方がないと思い、伸展台の温度をもう５℃ほど低めに設定されてみてはいかがでしょうか？

またもう一つ考えられる要因は、切片とスライドグラスの間に水分が残っていることです。切片をスライドグラスに載せた後は、スライドグラスを傾け、しっかりと濾紙に水分を吸い取らせる必要があります。
私の場合は、伸展台にキムタオル（薄い１枚にした物）を伸展台の上に敷き、切片をスライドグラスに載せた後、スライドグラスを傾けて、なかなか切片の下の水分が切れない場合は、切片の角を少し破って、そこに濾紙を当てて吸い出してました。こうすると、水泡のような物が出にくくなります。

さらに、薄切して切片をスライドグラスに取る前に、水ではなくお湯を使われていますか？この場合、お湯が高いと、当然脂肪組織は解離しやすくなりますので、温度には注意する必要があります。人肌より少し温かい位が適温です。水よりもお湯の方が伸びが良いので、お湯を使うこと自体は悪くないと思います。
さらに、私は脳組織を主に薄切していたのですが、その際には、１％酢酸水を温めたものに切片を浮かせて伸ばし、スライドグラスにすくってました。こうすると、きれいにしわもなく伸び、他の組織切片を作製する際も、多少臭いですが、きれいに仕上がるのでこの方法で行ってました。

一度お試しあれ…。

お礼

回答ありがとうございます。
気づいたらブロックがかなりなくなって
しまい不安になっていたのでとても助かりました。
明日sonorin様に教えていただいた方法で
再挑戦したいとおもいます！
ありがとうございました(^_^)

回答No.3

japonicus

以前魚卵を切っていました。魚卵も油分が多いので苦労しました。皆様御指摘の通り、温度が高いと組織がバラバラになりました。

パラフィン浸漬するとき、融解炉を使われていますか？

私はパラフィンを底面積の大きな容器に入れ、伸展器上で溶かして使っていました。発砲スチロール箱を裏返して被せておくことで表面が固まるのを防いでいました。
こうすることで、融解炉を使うよりも低い温度でパラフィン浸漬できます。
もちろん、炉の設定温度を下げれば良いのでしょうが、戸の開け閉め、組織の出し入れをしている間に表面が固まってしまうこともありますので、伸展器を使う方が浸漬処理が速やかに行えます。この方法には伸展器が２台必要です。

気泡は、長時間伸展器に載せたままの時によく出ました。3マイクロの切片で30分は長いかな？と思います。

皮下組織は扱ったことが無いのですが、伸展に時間がかかるならば、水をアスピレーターで減圧して脱気してから使用してはいかがでしょう？

お礼

回答ありがとうございます。
解答欄にでてきた「融解炉」なんですが
初耳でした。
ちょっとどうゆうものなのかイメージが
つきにくかったのですが…。
伸展板もひとつしかないので
温度を操作してなんとかやってみます。
ありがとうございました。

回答No.2

surprised_apple

大学の卒業研究で皮膚切片の薄切をしていました。
♯１の方とも同じ意見ですが、伸展版の温度が高いと思います。

私の場合、この薄切を行う卒研をしたのが研究室内で初めての試みだったので温度設定やら何から何まで手探り状態で進めていきました。

教科書にはそのような温度が書いてあるのかもしれませんが、私は最初４２度で始めて、それでもどうしてもばらばらに崩れてしまうということでどんどん温度を下げて最終的には３５度にしていました。
伸展版の可能最低温度でした。

また、スライドグラスに乗せる前の湯の温度も最終的に３７度にしました。それでも、あまりしつこく湯中に置くと崩れやすくなります。

色々やってみてわかったことなのですが、
研究を始めた当初、練習をかねて先生が以前作ったパラフィンブロックで薄切、切片を作製したのですが、その時は温度も４０度以上で問題なくキレイに作製できていました。
ところが、その中でも比較的最近に作られたものは４０度ではあっという間に崩れてしまい、温度を下げなければなりませんでした。
最近作ったからどうこうということを言いたいのではないのですが、先生いわく、パラフィン包埋する際のパラフィンにつけおく時間が最近の分は短かったということらしいです。
色々書籍で調べたところ、十分にパラフィンが浸透しないと崩れやすくなるようです。

組織の中に泡ぶくが見られるのは、湯（水？）中からスライドグラスにすくう時に空気が入っているか、水切りが不十分で乾いたあとにその水分があったところが空洞になってしまうかだと思います。
出来る限り水きりをした方がいいと思います。

参考になれば幸いです。

お礼

回答ありがとうございます。
組織に合った伸展版の温度を見つけたいと思います。
あとパラフィンが浸透してないと崩れやすいというのも初耳でした。
貴重な情報ありがとうございます。