インサートの向きについて

2007/08/22 21:14

現在、ある構造遺伝子をTベクター（Novagen：pT7Blue T-Vector ）に導入後、制限酵素で切ってIres－Dsredベクター導入しようと考えております。しかし、Tベクターに導入する際、何回やっても逆向きにしか入りません。この場合どうしたらよいのでしょうか？よろしくお願いします。

質問者が選んだベストアンサー

2007/08/22 21:56 回答No.1

順向きに入ったときleakyな発現によって、大腸菌の生育に有害なタンパク質が発現してしまうという可能性があります。培地にグルコースを0.1～0.2％程度添加する（lac promoterを抑制する）、25～30℃に培養温度を下げる（プラスミドのコピー数を下げる）を試してみては

2007/08/22 23:12 回答No.3

逆向きのクローンをテンプレートに、制限酵素サイト付きのプライマーでインサート部分を増やして、目的のベクターに導入したほうが早いかもしれません。

2007/08/22 22:13 回答No.2

＞培地にグルコースを0.1～0.2％程度添加する（lac promoterを抑制する）そのまえに、IPTG、X-Galを入れてblue/white selectionをしているのなら、それをあきらめて、IPTGを入れないことですね。