DNA切断分析

質問

質問させていただきます。現在進行中の実験において、あまり詳しいことはかけないのですが、アイデアをください。
　現在、ある高分子を利用してDNAの切断活性を評価しています。その際に、DNAの切断を評価するに際にアガロースゲル電気泳動により評価を行っているのですが、あまりに高分子でかつDNAに相互作用するために、濃度が濃い場合にはゲル中を流れないためか、バンドが現われません。また、バンドが現われるくらい濃度を薄くすると、DNA切断が十分にされませんでした。そこで、濃度がある程度高い状態で、かつDNAの切断を評価できる方法はありませんでしょうか？
　情報が不十分だと思いますが、推測できる範囲でアイデアをください。私は遺伝子分析の知識があまりないので、どうか知恵を貸してください。よろしくお願いします。

回答No.5

tomoyaok · ベストアンサー

バンドが見えないのは切断効率が良すぎるからでは、
アガロースゲルのバンド出現レンジよりも小さいかも。
ＰＡＧＥを試してみたら。

お礼

お礼が遅くなり、申し訳ありません。
切断効率がよすぎるのかも知れないとも考えたのですが、UV照射による撮影の際アプライしたところに蛍光が現われ、ブランクでは現われていなかったので、泳動できていないのでは？と判断しています。
PAGEとはどのような方法なのでしょうか？電気泳動は専門外で本当に知識がないので、お恥かしいのですが詳細をお願いします。

回答No.6

tomoyaok

#5です。
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動です。
タンパク質の分離・精製等に使われます。
しかしながら、それではおそらく解決できないでしょう。
もっとゆるいゲルをつくるか、一度ゲル濾過でサイズを確認するとか。

ポリ多糖を分解する酵素を試してみたらいかがでしょう。
例えば、アミロースに対するアミラーゼとか、でおそらく
糖のＯＨ基でがっちり結合しているでしょうから
（ホントにそうかな、それだと沈殿しないだろうか）
糖残基同士の結合にアタックする酵素がいいでしょう。

回答No.4

Dr_Hyper

高分子がDNAの切断およびDNAにも結合するため？にアガロースゲルの泳動に影響を及ぼすのですね。一般的には有機抽出、簡単にはフェノールクロロフォルム処理を行い、濃縮の為にエタノール沈殿を行います。
高分子の濃度が影響するのであれば、DNAの検出を高感度の試薬にへんすれば今の1/10程度のDNA量を検出できますので、高分子が高濃度になることは無いかと思います。ただ低濃度でもDNAにかなり結合するような物であれば、DNA構造をエチブロなどで変化させるなどトリックが必要となってきます。すべては高分子がどのような性質かによりますので、もし詳細が効きたければ、差し支えの無い範囲でその分子の補足をしてください。ちなみにその高分子がタンパク質であればProKなどの分解酵素を入れれば問題は解決されます。

お礼

お礼の返事が遅くなってすいません。アドバイスありがとうございました。高分子がDNAと強い相互作用をしているためか、泳動に影響を及ぼしてしまいます。言い方は正しくありませんが、高分子は主にポリ多糖を変形させたものです。これしか記載することは出来ません。申し訳ありません。もし、この情報で詳細をお聞きできればよろしくお願いします。お手数をおかけします。

回答No.3

lamb1204

細かい手順を示すのは情報が不十分なため難しいですが、方針としてぱっと思いつくものを二つほど。

１．切断処理後、その高分子とDNAを分離する。
薬剤・熱処理などでその高分子のDNAへの親和力を低下させる（あるいは分解させる）ことはできませんか？それができたら、DNAの精製もできませんか？

２．（半）定量的PCR。
その高分子がPCRに影響を及ぼさないなら、切断対象のDNAにもよるかもしれませんが、定量的PCRで切断の程度を測ることは可能かと思います。このときには、
>濃度がある程度高い状態
ではなくて、切断処理後に希釈して評価することになりますかね。

お礼

お礼の返事が遅くなってしまいました。申し訳ありません。
現在書ける情報が少なくて申し訳ありません。そんな中で、ここまでのアドバイスありがとうございます。
現在利用している高分子は、今の時点ではDNAにかなり相互作用が強いのではないかと考えています。強いDNAへの相互作用でもDNAと高分子とを分離することは可能でしょうか？分離させる方法は容易に出来るものなのでしょうか？
　知識が少なくお恥かしいですが、よろしくお願いします。

回答No.2

ebikichi

では十分切断してから、薄くすればよろしい

あるいは熱変性させるか

お礼

お礼の返事が遅くなって申し訳ありません。
アドバイスありがとうございます。切断してからの希釈は考え付きませんでした。この方法でやってみようと思います。ありがとうございました。

回答No.1

noname#69788

制限酵素をつかっているのですか。

お礼

お礼が遅くなって申し訳ありません。
制限酵素ではなく、DNAを切断する可能性のある合成した高分子です。実験上詳しいことを話せないので本当に申し訳ありません。