細胞の増殖率が急に弱くなりました。

質問

ＳＩＲＣ細胞の増殖をしているのですが
急に増殖率が半分以下くらいになってしまいました。
夏に細胞が全滅してしまい
よそ様から株わけしてもらってから全然細胞の増殖が悪い感じです。
培地の変化はありません。
培地はＤＭＥＭに１０％ＦＢＳ添加したものを使っています。
どうしたらいいのか
細胞学に詳しくないので基本的なこともわかりません。
どうかアドバイスお願いします。

回答No.5

Dr_Hyper · ベストアンサー

NO.3です。
non-essential amino acidsはGIBCOなど主要な培養液を販売しているメーカーで購入できます。100倍「希釈」でだいたい使用します。
ロットチェックですが、出入りの業者のヒトに血清のロットチェックがしたいと持ちかけてみてください。血清は高価なものですので、喜んで10-30ml程度の小分けにしたロットサンプルをもってきてくれます。頼むときにデリケートな細胞でFBSでも何種類か試さないとだめかも。といっておくと２－３種類はもってきてくれると思います。出入り業者数社に声をかければ合計でかなりの数を試せますが、数日後「で、血清どうでした？？」攻撃にあいますので覚悟はしておいてください。
どれも違いが無くて、購入に踏み切れない場合には、あいにくどれもいまいちでしたといって、文句を言われることはありませんので思い切って頼んでみてください。試し方は簡単でそれらの小分けの血清を同じように別々のDMEMにいれて、元の培養液と比較すればいいのです。時には数週間培養を続けないと差が見られない場合もありますが、今の場合がんがん増えるのが目的であれば、増殖曲線を書くなどして比較知ればいいでしょう。ちなみに全部増殖がいい場合などは血清量を１％などにしたりして比較しますが、あなたの場合には最初は１０％からはじめるべきですね。

ひとつだけ疑問があります。あなたの今の細胞の増殖は本来の増殖に比べて著しく遅いのですね。本来というのは文献なり、ATCCの資料と比べてということです。繊維が細胞というのは時に形質を転換することがあります。CSで培養しないと行けない細胞をFBSで培養した為に癌化してしまったということもあります。この例などはCSよりもFBSの方がよく育つからと言う理由で勝手にFBSに変えてしまった為に、普通に培養していても形態の違う細胞が出てきてしまうというものです。
貰ったものが普通で、あなたの培養していたのが異常を起こしていたということはないですか？以上な増殖でゲノムが不安定になり結局死んでしまったなんて逆説的なことも考えるのは研究者の悪い癖ですね。
失礼。

お礼

再訪問いただきありがとうございます。
non-essential amino acidsをGIBCOで早速購入してみます。
培地に混ぜてしまってキープしておいてもいいのでしょうか。
質問攻めですみません。
血清もちょっと変えてみたりして
業者さんにサンプルを頼んでいろいろ試してみたいと思います。
血清を変えてみるという考えも浮かびませんでしたので。
それぞれの増殖曲線を描いてみます。

あとは
『本来』というのは全然まだ調べておりませんでした。
基本的なことですよね。
調べてみます。
ATCCの資料などは英語なのでちょっと苦手なのですが
なんとか解読してみます。
ありがとうございました。
また方向違いなことを考えているようならば
心温かいアドバイスお願いします。

補足

non-essential amino acidsは
ＧＩＢＣＯでいうと
ＭＥＭ必須アミノ酸溶液（１００×）、液体１１１４０－０５０
のもので合っているのでしょうか。
0.1ｍＭというのはなくて１０ｍＭならあるのですが
１０ｍＭを培地に１００倍希釈でいいのでしょうか。
それとも0.1ｍＭを１００倍希釈でいいのでしょうか。

回答No.7

MIYD

トリプシンやEDTAの濃度、かける時間については
その細胞を使ったことが無いのでわかりません。

もちろんその細胞で推奨されている条件なんですよね。

ただ、私が使ったことがある細胞で10分間のトリプシン処理に耐えられそうなものは思いつきません。
よほど丈夫な細胞なのですね。

回答No.6

MIYD

サプリメントや、
トリプシン処理の時間をかけ過ぎではないかとかは
もらった先に確認するしかありませんが

ロットチェックとは
ラボによって少し違いがあると思いますが大体の流れで言うと、

業者さんに言って、複数のロットの血清のサンプルをもらいます
（チェックしている間はその血清を他に売らないようにしてもらいます）
それらの血清を使って細胞を飼い2~3回継代します。
(ここでの操作、使う細胞などがラボごとにあります)
それで増殖に問題ない血清を選び、購入します。

という操作です。

通常はラボでチェックするための細胞が1つまたは数個あると思いますが、
新しく来た細胞がデリケートなものの場合、
そのチェックで選んだものではだめで、
新しくチェックする必要がある場合があります。

血清は血から作っているため、
1回作成するごとに微妙に成分が変わってしまいます。
そのため、自分の細胞に合った血清を自分が使いたい細胞で調べる必要があります。

悪い血清の場合、他の血清と同じ濃度を入れても、
シャーレに張り付きもしない場合があります。
その血清でも大丈夫な細胞もいたりするので難しいです。

お礼

ありがとうございます。
トリプシンは38度で１０分程度にしていますが
かけすぎでしょうか。
一応確認してみます。

血清は一回作成するごとに微妙にちがってくるのですね。
ロットごとに注意を払わなくてはいけないということは
知りませんでした。
ロットについても
チェックしてみたいともいます。

貴重なアドバイスありがとうございました

回答No.4

noname#160718

他の方の回答で解決法は出尽くした感がありますが、気が付いたことをもうひとつだけ。

　細胞の分与元がどうやってその細胞を飼っていたか、聞いておく必要があると思います。
　たまにTPBとかBESを入れてるとか、変わったことをしている場合がありますので。
　質問者さんの培養方法が「標準」であったとしても、今まで飼われていた環境と変わってしまうと、細胞が拗ねてしまうことが多々ありますね。

　継代して３日目にメディウムチェンジ、７日目に継代という飼い方をしていた細胞を、メディウムチェンジせずに培養したら３代で全滅したこともありますし、その逆もあったりします。
　なので私は、細胞を分与してもらうときは培養方法を詳しく聞くことにしていますし、また分与するときも詳しく教えることにしています。

お礼

回答いただきありがとうございます。
一応分与元とまったく同じように細胞を育てています。
念のためもう一度確認とってみようとおもいます。

ちゃんと育ってくれることを祈っています。
皆さんの知恵で細胞が元通りになるといいなぁ。
お手数かけますが
また気付いた点がありましたら
アドバイスいただけると助かります。
よろしくお願いします。

回答No.3

Dr_Hyper

培地に0.1 mM non-essential amino acidsを入れていないようですが、貰ったときに必要ないといわれましたか？その場合血清のロットが重要になってくる場合があり、一度このアミノ酸カクテルを購入して入れてみるべきです。細胞がその環境に対応してしまう場合もありこれだ！というほどの改善策ではありませんが繊維が細胞にはよくあることですので試してみてください。もう一つこの手の細胞はトリプシンにあまりつよくありません、トリプシンを血清入りの培地で失活させたあと、遠心してその培地ものぞいて新しい培地でまき直すなど気を使った方がいい場合もあります。あとはみなさんがおっしゃっている通り、血清のロット。貰った細胞はまずたくさんのdishに増やして凍結保存し、調子が悪くなればすぐに新しいのを起こし直して比較するのが良いと思います。

お礼

回答ありがとうございます。
0.1 mM non-essential amino acids初めて聞きました。
細胞内で細胞分裂に使われるエネルギーの供給を促すためのものですよね。
ネットで私なりに調べたのですが
血清入りの培地に100倍濃度ぐらいで添加するかんじでしょうか。
全然違ったこと言っていたらすみません。
トリプシンに弱いことも知りませんでした。
無知で恥ずかしい限りです。
遠心して培地を取り除いてもうすこし過保護にしてみます。
このとき遠心する場合はどのくらいの回転数まででも大丈夫なのでしょうか。
血清のロットはどのようにみてやればいいのかわかりません。
教えていただけると大変助かります。
この本やHPを見るとかの情報だけでも助かります。
大変ありがとうございました。

回答No.2

bunnosukehina

一番考えやすいのが血清です。
ロットチェックしたものかどうか確認してください。
Cell Lineは、一度Over Growthさせると急に増殖が悪くなるときがありますが、そのようなことはなかったですか？
70-80%confluent程度で継代するのが良いようです。
基本的なこととして、当然、培地には抗生物質を加えていますよね?
感染により細胞が弱ったり、死ぬことも、まれですが有り得ますので。
ATCCではPyruvateを加えたMEM培地で培養することも薦められていますので、一度試してみてはどうでしょうか。

参考URL：

http://www.atcc.org/Home.cfm

お礼

回答いただきありがとうございます。
当方まだ初心者なので
「ロットチェック」という言葉すら
どうしていいかわからない状態です。
勉強不足ですみません。
培地には抗生物質を加えていません。
上記にも書きましたが
FBSしか入れていません。
抗生物質を入れてやることで
細胞が強くなったりするのですか。
本当にそういうことすら知らなくて恥ずかしいです。
こういうことは何を見てやればわかるのでしょうか。
継代は大体８～１０割のconfluent程度のものを使用しています。
７～８割とは知りませんでした。
次回そうしてみたいと思います。
Pyruvateを加えたMEM培地のほうも購入してみたいと思います。
またいろいろ教えてください。
ありがとうございました。

回答No.1

MIYD

バイアルかフラスコなどで1つ貰ってきて、
それを増やしてストックして、
それを起こして使っていて、
複数のバイアルを起こしてもどれも増殖が悪いということでしょうか。

夏から今までに行って、効果が無かった操作は何でしょうか。

貰った細胞が初めから調子が悪いのでしたら、
細胞か血清が問題だと思います。

血清のロットは大丈夫でしょうか。
その細胞にあっていないのでしたら、
ロットチェックからはじめる必要があるかと思います。

今起きている細胞が調子が悪いのでしたら、
起こしなおした方が早いことが多いです。
一度おかしくなった細胞が、本当に戻ったのかはわかりませんので。
起こしなおしてもダメならば、貰いなおした方が早いと思います。

まさか貰った細胞を夏から継代し続けていて、
ストックをしていないということはありませんよね。

お礼

素早い回答ありがとうございます。
フラスコで1つ２つもらってきて起こして使っていて
増殖が悪いです。

夏から今までしてきたのは
どうも増殖が悪いので

１．２割増しに多めに細胞をまいてみたり
FBSをちょっと多めにしたり
こまめに培地をかえてみたり

って感じです。
無知なものでなかなかどうしていいかわからず。
血清のロットというと
どうみればいいのか全然わからないのですが（初歩的な質問ですみません）
ロットチェックとは
どうみるのか教えていただけませんか？

夏にもらった細胞のストックしてはありますので
それを起こしなおしてみたりもしているのですが
それでも鈍いのです。

初歩的な質問で申し訳ありませんが
教えていただけると大変助かります。