pGL3-エンハンサーベクターについて

質問

ルシフェラーゼアッセイを行った時、ベーシックベクターよりも活性がでることを期待してエンハンサーベクターでも測定しました。しかし、結果は逆にベーシックよりも活性が下がってしまいました。このようになってしまったことの原因がよくわかりません。エンハンサーを用いても必ずしも効果があがるとは限らないのでしょうか。どなたか助言していただければありがたいです。宜しくお願い致します。

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

○トランスフェクション効率はRenillaなどで確認されているのでしょうか。

○両者のプロモーター活性が低いためにバックグラウンドに埋もれたために、
たまたまエンハンサーのほうが低くなったということは無いのでしょうか。

その辺りを確認された上でプロモーター活性が下がっているのでしたら、
その細胞ではそのベクターでは、SV40エンハンサーが転写を抑制している可能性があるのかもしれません。

ところで、
ポジティブコントロールとして発現させるのならば、controlベクターを使うと思いますが、
なぜプロモーターの無いenhancerを使われたのでしょうか。

pGL3のマニュアルでは、HeLa細胞ではbasicとenhancerの違いがcontrolと比較して、0.04%と1.39%で比率で言えば30倍以上ありますが、
絶対値としてはあまり無いようですが。

お礼

詳しいご回答有難うございます。お礼が遅くなりまして大変申し訳ございません。トランスフェクション効率はRenillaで確認しています。HepG2とFLC7細胞を使用していたのですが、特にFLC7ではかなり活性が下がっていたのでSV40エンハンサーが転写を抑制しているのかもしれまうせん。。エンハンサーを使用したのは、以前うちの研究室でルシフェアーゼをやっていた先輩が、ベーシックでは全く活性がでなく、エンハンサーにしたところ活性が非常にあがったというデータがあったのでベーシックと両方同時にやってみました。（そのときはHepG2とHeLaを使用していました）でも、私の場合は、ベーシックでも活性に差がでたのでよいということにしました。