ミトコンドリア酵素活性

質問

実験結果がおかしくて、悩んでいます。ラットの肝臓を使い遠心分離によってミトコンドリア分画、サイトソル、ミクロソーム分画に分け、各分画の酵素活性を分光光度計によって調べました。
　シトクロムｃ酸化酵素の活性測定をしたところ通常ならミトコンドリア分画のみに活性が見られるはずなのに、ミクロソームに大きく活性が見られ、ミトコンドリア分画はほとんどといっていいほど活性が見られませんでした。この原因として何が考えられますか？教えてください。
　私自身が今考えられる原因として、分画をする際にミトコンドリア分画がそのほかの分画に混ざってしまったためミクロソームに活性が見られた。またミトコンドリアに活性が見られなかったのは温度か何かで酵素、もしくはミトコンドリアが失活したと考えています。これらは間違っているでしょうか？助言お願いします。

回答No.2

kaazuu · ベストアンサー

おそらくホモジネートがうまくいってないんじゃないかな、と思います。
トリパンブルー染色とかで顕微鏡下で破砕した細胞をみてみればいいのではないでしょうか？
私は培養ガン細胞からミトコンドリアを分離する際には、ちゃんとつぶれたか顕微鏡で見ています。

お礼

回答ありがとうございます。同じようにホモジネートしたラットの肝臓で、他の班はきちんとミトコンドリアに活性が出ていましたので、ホモジネートがうまくいっていないとは考えにくいのですがどうでしょうか？せっかく答えてくださったのに申し訳ありません。他に何か原因はありませんか？助言お願いします。

回答No.1

kame1973

詳しい実験のプロトコールが不明ですので、的確な回答かわかりませんが、最初のホモジネートや、各段階の酵素活性は測定していますか？
シトクロムｃ酸化酵素の活性だけでなくサイトゾルやミクロソームのマーカーエンザイムの測定はしていますか？
ミトコンドリアについても他の酵素活性を測定してみてはいかがでしょうか？
あと、ホモジネート作成時に熱がかかってはいませんか？
タンパクの比活性などをだしてみると原因のひとつがわかるかもしれません。

お礼

回答有り難うございました。シトクロムｃ酸化酵素だけでなく、グルコース６リン酸脱水素酵素や、NADH－シトクロムｃ還元酵素の活性測定もミトコンドリア、サイトソル、ミクロソームの３種類で同様に測定しました。グルコース６リン酸脱水素酵素や、NADH－シトクロムｃ還元酵素ではほぼ理想の結果が出たのですが、シトクロムｃ酸化酵素だけ結果がおかしかったので、理由がいまいち分からなくて。測定は0分、1分、2分、5分、10分間隔で行いました。ホモジネートの際は氷で完全に冷やしながら行ったので熱はかかっていないと思います。
　どれくらいの熱で活性が無くなったりするのでしょうか？