ルシフェラーゼアッセイの統計処理についてです。

質問

ルシフェラーゼアッセイの統計処理についてです。
私の研究室は人数が少なく、先生も曖昧でしたので質問させていただきました。現在SNPsが転写活性に及ぼす影響の程度を見るためにルシフェラーゼアッセイを行っており、n=6で同じ実験を三回行いました。ウミシイタケを補正に使っております。しかし、三回で得られたデータは、傾向はほぼ同じものの、値(ホタルとウミシイタケの比など)はかなり異なるものでした。と言いますのは、おそらく試薬(PromegaのDualを使ってます)が凍結・解答を繰り返したことにより、ホタルの値が高かったり低かったりしてしまいました(例えば多型1と2と3のホタル/ウミシイタケの値が一回目では10、20、30だったとすると、二回目は30、40、50となってしまったような感じです)。そこで二点疑問に思い、未だ統計処理ができておりません。疑問は以下の通りです。

1.統計処理を行う際、n=6の実験を三回ということで、n=18で処理してよいのでしょうか。経代数など少なからず条件は変わっているのに一まとめで考えていいのでしょうか。論文を見ると、n=3を三回がほとんどな上、統計処理は一まとめで行っているものが多い気がしています。

2.ホタルの値の補正は行わないのでしょうか。恐らくウミシイタケで補正を行うのみが普通だと思いますが、ホタルの値は試薬(ホタルを発光させる試薬、Promegaで言うとLAR2)の状態やlotで少なからず変わるはずです。ウミシイタケとの比を求めることで細胞数や手技的な補正は行えますが、ホタルの発光させる試薬の状態によるホタルの値には影響しないはずです(初めに述べたように傾向はほぼ同じですが比の値が異なってしまいます。再度詳しく言わせていただきますと、一回目は試薬を二回解凍したせいか多型1、2、3でホタル値がそれぞれ5、10、15、ウミシイタケ値が0.5、0.5、0.5であったとしたら、二回目は試薬を新しく調製したものを使用したらホタルの値のみ上がり、ホタルがそれぞれ15、20、25となりウミシイタケは0.5、0.5、0.5のままで、グラフとしての傾向は同じだが値はかなり異なってしまいました)。

これらを一まとめで考えますと、エラーバーがとんでもないことになります。しかし、それぞれ一回のアッセイずつでグラフを書くと、ほぼ同じグラフになります。ホタルの値についても補正するため、何か一定のホタル発光強度があるものもそれぞれの系列で測定し、補正をする必要があるのではないでしょうか(mockのホタル値などで)。むしろホタルの補正を行わなければ三回のデータを一まとめで考えてはいけない気がします。またその補正方法を論文に記載する必要があるのでしょうか。勉強不足で、また長々と大変申し訳ないのですが、非常に困っております。何卒よろしくお願い申し上げます。

回答No.1

tatoo

いきなり最終的なコメントで申し訳ありませんが、

同じような実験をしている論文があると思います。
同じようにルシフェラーゼアッセイをして結果を掲載した論文があると思います。

それではどのように解析したのかを参考にされる方が、一番の近道だと思います。
そのような論文は、査読の際、その道のプロたちが「そのアッセイは正しい」と判定したものです。

それを参考にされると、一般的に受け入れられるというものです。

お礼

早速のご回答、誠にありがとうございます。
おっしゃる通り、私の努力が足りない部分があり、大変申し訳ございません。何報も読み上げれば見えてくるかも知れません。
ただ、大変申し訳ないのですが、私の場合、24wellを使用したことから勝手にn=6で行ってしまい、実験終了後に統計処理を行う際に多くの論文を読み、そして通常n=3で三回行った平均値をとっていることを知りました。より多くのデータがあるにも関わらず、n=3にするためにデータを三個ずつ選んで抽出するのはどこか違和感があり、また今回の私のようなケースや標準化を誰かが行ったことはあるのかを知りたく思いました。しかしながらtatoo様のおっしゃることは正しく、私の無知さを痛感しております。誠に勝手ではありますが、よろしければ皆様のルシフェラーゼアッセイの統計処理についてどのように行っており、私の場合はどのようにするのが良いのかもう少しご指導・ご意見をうかがわせいただいてもよろしいでしょうか。