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ロイシンウリジンの取り込みについて
- 細胞に薬剤を入れて、タンパクとRNA合成がどのように変化するかという実験をしています。
- 今までの実験ではロイシンとウリジンの取り込み量が少なかったため、新たにコールドのロイシンとウリジンを加える実験を行いました。
- 実験結果から、加えるコールドのロイシンとウリジンの濃度についてアドバイスをいただきたいです。
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>反応をとめて細胞を集め、洗い、細胞のペレットをいきなり５％TCA処理して（界面活性剤はなにも加えません）、それを遠心もせずにGF/F フィルターにトラップさせてそれをカウントしています。 この方法だと、高分子に取り込まれたものだけでなく、膜胞（一番大きいものが細胞膜）に取り込まれたものすべてがトラップされます。フィルターを洗う時の洗浄液を工夫すれば、それでも良いかもしれませんが．．．．この実験だと、取り込み活性の測定を観ているだけのような気がします。面倒でも、細胞破砕のステップを入れる事をすすめます。 例えば、1mM Leu、5% SDSを含むPBSで懸濁して、一定時間インキュベートし、それからTCA沈殿させ（フィルターだけでも良いです）、そのフィルターを1mM Leuを含むPBSで十分洗って、フィルターのカウントを測定してごらんなさい。コールドのロイシンで洗うのは、吸着しているモノマーを交換するためです。タンパク質に取り込まれたLeuは入れ替わりませんから、高分子に取り込まれたホットの量（これが調べたいタンパク質合成量）はそのままで、バックを減らす事ができます。 今測定している、カウントから計算して、通常のタンパク質合成量に合いますか？おそらく、その何十倍かあるのでは？
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- Sbacteria
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＞培地はES mediunm 2%FBSです。 と言うことは、培地中に既に十分量のLeuは含まれているということですね。それなら、少量のホットのLeuを加えても十分なはずです。 次は、どういう操作をして、何の放射活性を計っていて、それがどうなっているのか？（文章を読んだだけでは、何が悪いのか全く理解できません）説明してください。 ある薬剤を加えた実験系 Iと加えない（あるいは薬剤だけ抜いたものを加える）実験系 IIを比較するとします。 まず、最初に薬剤が細胞の生育に影響があるか調べ、濃度依存性を調べておきます（ここまではやってあるのですね？）。薬剤の効果の何をみたいのかがさっぱり分からないので、想像するしか無いですが、生育阻害が観察できるぎりぎりの濃度で、実験して、実験系I, IIの両方にホットのLeuを加えます。 次に、一定時間後、コールドのLeuを大量に添加して、細胞をプレートから剥離して、遠心で集めます。ここからは、（１）界面活性剤を十分に含んだ溶液に溶かして、SDS-PAGEにかけ、高分子への取り込みをオートラジオグラフィーで観察する か、 （２）界面活性剤で抽出した溶液（軽い遠心でデブリスは捨てる）を酸変性させて、高分子をフィルターでトラップして、トラップされた放射活性をシンチレーターで測定する。 の２つがあり得ますが、（１）の方が実験としては面白いと思います。 想像で手順を書きましたが、実際はどうしているのでしょうか？
補足
たびたびありがとうございます。 使用している薬剤はｍRNAのハイプシン化の 阻害をしるのではないかと考えられています。 薬剤の濃度等は以前の学生が実験をして 論文を出しています。 ｍRNAの量の違いをみるまえに、total RNAと タンパク合成量の違いをみようということに なっています。 薬剤を入れて一時間カルチャー後に、コールドの ウリジン、ロイシンそれぞれで、反応をとめて 細胞を集め、洗い、細胞のペレットをいきなり ５％TCA処理して（界面活性剤はなにも 加えません）、それを遠心もせずに GF/F フィルターにトラップさせてそれを カウントしています。 デブリスっていうのは細胞片ということでしょうか？ それごとトラップしています。 これまでもこの研究室ではこういう 方法で実験をしていましたが、どうなんでしょう？ 改善すべき点等教えていただけますでしょうか。 よろしくお願いいたします。
- Sbacteria
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培養している細胞は何か？その遺伝子型は？ 使用している培地の組成は？ これらが記述されていないと一般論で話をするしかありません。 通常は、ロイシンはNa+とのシンポートで細胞内に輸送されるので、使用している生物のLeu/Na synporter のLeuに対するKmが分かっていれば、その3-5培程度入っていれば十分だと思います。 適正かどうかは、どうやって判断していますか？
補足
Km値は以前はかったことがあるとかないとか で、わかりません。 細胞は mouse mammary carcinoma FM3A cellを つかっています。培地はES mediunm 2%FBSです。 １０μMでしなさいと指示をされ、間違えて 一回目は１００μM加えてしまいまして、次に １０μMで実験をしたところ、ロイシンに関しては RIのシンチレーションのカウントがほとんど 変わらないので、１００μM以上入れなさいと 次回の実験の指示がでました。 （以前コールドのロイシンを加えなかったときに 比べるとカウントは3分の１下がっています） ウリジンに関しては、１０、１００両者とも コールドを加えないときの実験のときと カウントが変わらないので、これももっと 増やしてするように言われています。
お礼
どうもありがとうございます。 今 上の人たちが不在なので来週実験に ついて話をしたいと思っています。 もっとおうかがいしたいことが出てくる と思うので、まだ締め切らずにいさせて もらいます。 またお願いします。