定量法が・・・

質問

臓器のプレパラートを作成し、標的タンパクに免疫染色をしようとしています。このときには臓器の処理方法をどうすればよいのでしょう？ホルムアルデヒドで固定してしまうと抗体が結合できなくなってしまう気がするのですが？

回答No.2

sonorin · ベストアンサー

蛋白である限り、凍結切片で検出は可能であるとは思うのですが、固定は通常のホルマリンですか？パラホルムアルデヒドではなくて？

パラフィン切片で免疫染色を行う場合、蛋白の種類によっては賦活処理を実施しなければ検出できない場合が多々あります。免疫染色に使う一次抗体は市販のものですか？それともmsm340さんの研究室で作製されたものですか？市販のものの場合は添付書類に凍結切片に向くか、無処理のパラフィン切片で染色可能か、賦活処理が必要か、必要であればどのような方法か、また組織染色には使用できないか等の詳細が書かれていると思われます。書かれていない場合、また自作の抗体の場合、その抗体を使用している論文を幾つか調べ、その方法をチェックし、その抗体にあった手段を選びます。またその蛋白自体が研究室が初めて発見したもので、そのような抗体を用いた発表がなされていない場合は、自分で試行錯誤を繰り返さなければなりません。

私が普段行っている方法について…、
１）（添付書類に何も記載がない場合）論文で検索し、最も多く使われている方法（賦活処理の有無、凍結かパラフィンか、希釈倍率）で、処理を施し、希釈倍率を５系列（添付書に100倍とあれば、100倍、300倍、500倍、1000倍、2000倍）ほど用意して同一連続切片で試す。（パラフィン切片では４℃、overnight）

２）（陽性に検出される希釈倍率が見つかった場合）それがパラフィン切片であれば、その希釈倍率で他の賦活処理を検討。
　　（陽性に検出されなかった場合）添付書通り（論文の方法通り）の希釈倍率で、他の賦活処理を検討。

賦活処理については、マイクロウェーブ処理をはじめ、色々述べられていますが、簡単な処理だけ記載します。

＜熱処理＞
オートクレーブ処理（121℃、10～20分間）：必ず耐熱用の染色壺を使用し、切片を浸す溶液は蒸留水でも良いが、0.01MPBS(pH7.4)あるいは0.01Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を用いる。脱パラフィン後、水洗した後処理する。
※マイクロウェーブを使用しなくてもこの処理で大抵はO.K.。（時にこの熱処理によって溶出する物質もあり、かえって検出できなくなる場合がある）

＜蟻酸処理＞
脱パラフィン・水洗後、濃蟻酸に5～10分間浸し（ドラフト内）、その後5分間流水水洗した後、通常の免疫染色工程を実施。（これもものによっては、検出されなくなる場合がある）

＜プロテアーゼ処理＞
Proteinase Kを10～20μg/ml濃度になるように0.05Mトリス-HCl緩衝液（pH7.4）で希釈し、脱パラフィン・水洗後、0.05Mトリス-HCl緩衝液に5分間浸漬後、切片を湿潤箱中に並べ、この酵素溶液を切片にまんべんなく載せて、37℃、30分間静置し、液を十分に切ってから再び 0.05Mトリス-HCl緩衝液で洗浄後、通常の免疫染色工程に移る。
※その他にトリプシンを用いた処理もあるが、組織障害はProteinase Kの方が少ない。（この方法が最も堅実）

以上の手段を色々と講じられてはいかがですか？
検出できない原因として考えられるのは、賦活処理等の選択以外に、一次抗体の希釈率の不適や、使用した緩衝液が不適（あまり考えられませんが）等の可能性もあるので、一度以上の方法を全て試してみてください。
しかし、何よりもまず、同様の蛋白に対する抗体を用いた免疫組織染色を実施している論文の方法欄をもう一度チェックし、自分が今まで失敗してきた方法と照らし合わせることが第一です。

頑張ってください。

お礼

ありがとうございます。抗体は一応購入したものですが、特にマニュアルは無かったと思います。現在、別の方法で検討していますが、抗体が高くって・・・。まあ、作っている時間は無いのでふところをいためながらやります。ありがとうございます。

回答No.3

noname#17364

こんにちは。
となると、第3者からの意見としては、in situの手技に問題があるのではないかと思います。陽性コントロールを置いて、とりあえず系に問題がないかを確認されてはいかがでしょうか？（確認済みでしたらすみません）系が動いているのであれば、あとはsonorinさんが詳細に指摘されているように、様々なパラメーターで調整していくのが順当じゃないかと思います。
またもや一般論ですが..。

お礼

系のほうはおそらく問題ないと思います。確かに同じ方法で確認できたという報告がある以上できるのだとは思いますが・・・。下手をするとタンパクの発現量が少ない可能性も出てきました。タンパク発現を活性化する必要があるかも知れません。

回答No.1

noname#17364

こんばんわ。
標的にする蛋白と、使う抗体によりけりです。ホルマリンでOKのものもあれば、だめなものもあります。凍結切片が良いものや、特殊なコンパウンドで保存するやり方もあります。
市販の抗体をご利用であれば添付のマニュアルに注意事項が記載されているでしょう。それに従ってやればいいとおもいます。そうでなければ、参考にしている文献を良く読んで、同じようにやればできるんじゃないでしょうか？
ちょっと一般的な回答ですが、ご参考になればいいのですが。

お礼

ありがとうございます。このタンパクはisoformがたくさんあるので参考文献も完全にヒットしているわけではありませんが、参考文献にはホルマリンに・・・とあります。標的タンパクはglucose transporterで、ウエスタンブロットでは検出できるのですが、ホルマリン漬けの臓器をスライスしてプレパラートを作って抗体を結合させようとするとくっつきません(というか検出できません）。ちなみに臓器は腎臓です。凍結切片も試してみましたがこれもだめでした。となると考えられる原因は？？？