ELISAの固層化の条件について

質問

タンパク溶液の中から、抗体濃度を測定するのに、ELISAによる方法を考えています。
Protein A (or G) をコーティングしたプレートを作製したいのですが、適切な固層化の条件(Buffer,反応時間,温度など)を教えていただけませんでしょうか。
またマイクロプレートの吸着性については、どういった種類のものを選べば良いのでしょうか。
注意点や他の方法などもありましたら、教えて下さい。
よろしくお願いします。

回答No.4

okemimania · ベストアンサー

こんにちは。べつのところに書いてしまいます。丁寧なお返事ありがとうございます。

すいません。言葉足らずでした。タンパク溶液が何なのか不明なのではっきりとはわからないのですが、BSA自身も抗体溶液なので。反応してしまうといけないと思いました。
実際私もマウスの抗体濃度を調べるときには、BSAではなくカゼインを用いました。

you wrote「タンパク溶液をそのままコーティングする方法はとても簡単だと思うのですが、その場合は、抗体濃度の基準(検量線)はどのように取っていらっしゃいますか。
濃度既知の抗体の希釈系列を作り、そのまま固層化するのでしょうか。」

まったくそのとおりです。がんばってください。

お礼

お忙しいところ、再度、ご回答下さいましてありがとうございました。教えていただいた方法ですと、ProteinAを用いずに、直接検出することができそうですね。あとは再現性あるデータが得られるよう、条件等を検討してみます。その際、ブロッキングにはカゼインを用いたいと思います。とても参考になりました。

回答No.3

okemimania

こんにちは。あたりまえのことしか言えなくてすいません。

ELISAの固層化の条件ですが、一般的な場合、
50～100 mM 炭酸Buffer（pH 9.5～9.6）に、そのProtein Aを適当な希釈（1000～10000倍、条件によります）をウェルに100μlずつ分注です。これを４℃くらいで１晩インキュベート。です。ただ、用いるプレートにもよります。プレートは高吸着のポリスチレン製に限ります。ウェル底は・・・検出方法がマイクロプレートリーダーを用いた比色測定なら平板です。

あと、ブロッキングにはBSAは使わないでくださいね。好みにもよりますが、安いのはカゼインでしょうか。

ところで、タンパク溶液中の抗体濃度を検出するのでしたら、そのタンパク溶液を初めに固層化したほうが楽だと思いますよ。でしゃばってすいません。

最後に、参考書としてですが、秀潤社や羊土社から出版されているプロトコールを参考になさっては。私も初心者のときにはお世話になりました。とてもみやすくてわかりやすいと思います。では。

お礼

ありがとうございました。
ELISAはkitを用いた測定の経験しかないため、いろいろ教えていただき助かりました。ブロッキングにBSAを使わない理由を教えていただけますでしょうか。
タンパク溶液をそのままコーティングする方法はとても簡単だと思うのですが、その場合は、抗体濃度の基準(検量線)はどのように取っていらっしゃいますか。
濃度既知の抗体の希釈系列を作り、そのまま固層化するのでしょうか。お時間ありましたら、ご回答いただけましたら幸いです。

回答No.2

kexe

抗体濃度の測定ということですが
花粉症などのアレルギーに関するヒトIgE抗体価・量を調べるのに
youcagouさんと同じ流れのELISAが用いられている例があります．
（ただしantiIgEの抗体を最初に吸着させています．）
AlaSTATなどとか言われる方法もありますが
原理的には似たところがあります．
もし他に例がないかお探しでしたら
参考になれば幸いです．

お礼

ご回答、どうもありがとうございました。
アレルギー関係の文献に抗体濃度測定のELISAの方法が多く用いられていそうですね。探してみます。 参考になりました。

回答No.1

ADEMU

固層化の条件は試薬の能書あたりに書いてあると思いますが、それほどシビアなものではありません。ただ、毎回同じ条件で行わないとロットによって全く違うものができてしまします。マイクロプレートも１枚２００円くらいのもので充分だと思います。ただ、ブロッキング剤など適性なものを使用しないと非特異的な反応がおこり、何を測定しているのかわからなくなりますので注意が必要です。
また、一番の注意点として、自分で測定系を組んだ場合、その系をだれが保証するのかという問題があります。文献にでも記載されているのであればあまり問題ありませんが、そうでない場合は測定系の基礎的な検討はおこなうべきだと思います。再現性、希釈定量性（この場合、抗体濃度なので定量性はないとは思いますが）、感度、干渉物質の影響など。

お礼

早速のご回答、どうもありがとうございました。
ELISAによる方法が一番簡単に測定できるのではないかと思ったのですが、始めのコーティング、ブロッキングのところを十分に検討しないと、根本的なところでミスをしてしまいがちですね。再現性という点では、少々高価であっても市販のプレートを用いた方が確実なのかもしれませんね。
ありがとうございました。