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DNAに対する高温の影響
DNAに対する高温の影響を教えて下さい。 最近ABI 377 Sequenserで、解析の際サンプル、サイズスタンダードとも非常に薄くしか認められませんでした。（ゲルイメージで、肉眼でかろうじて確認出来るくらい。解析の際、ピークの高さが非常に低いです。特にサイズの大きいものがそうでした。） サンプルを流す前に98℃で数分、denatureしますが、このdenatureに使うheat blockが悪く、温度が表示されている98℃よりかなり高かった為、DNAがダメージを受けた事が原因ではないかという事になりました。 heat blockを他のものに変えたら正常に認められる様になりました。 高温でDNAにダメージが与えられるという事ですが、これは、脱プリンされるからという事ですか？ また、サイズの大きいDNAの方が影響が大きいのはなぜですか？ また、ABI 377 Sequenserで泳動の際に、うちの施設では98℃7分間denatureしますが、98℃は温度がやや高過ぎませんか？これくらいは影響ないですか？ （95℃5分くらいでいいように思いますが） 宜しくお願い致します。
- 生物学
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- alice_with_tak
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No.2の補足です 蛍光化合物について、やはり室温で保管しておくと蛍光強度は低下していくという報告を聞いています。しかしながら蛍光化合物それ自体が分解するのか、蛍光化合物とddNTPの結合が失われるのかはわかりません。 サイズに関しては長いものは読みにくいです。ddNTPが結合し伸長が停止した各DNA断片はすべてが均等にあるわけではなく短いものが多く、長いものは少なくなってしまいます。よって長いものは必然的に強度が小さくなるので読みにくいのです。もし長いものを読むのであれば、キャピラリーの長さ、キャピラリーに充填するポリマーの種類、泳動スピード、泳動温度、テンプレートDNAの量などをかえるとうまく読めるようです。 熱変性に関しては、私たちの中でも行っている人もいてその場合は95℃、2minの条件で行っています。しかしながら結果にかわりはありませんでした。
- alice_with_tak
- ベストアンサー率55% (36/65)
おそらくDNAの破壊よりもシークエンサーによって読み取られる蛍光化合物の分解の可能性のほうが高いのではないでしょうか？サイズの大きいDNAの方が影響が大きいのは単にdNTP、ddNTPの数的な問題だと思います。 また熱変性プロトコルを行わないほうが良好な結果が得られるかもしれません。私の場合ABI3100を使用していますが熱変性を行わなくても良好な結果が得られています。
お礼
ご回答ありがとうございます。 なるほど、この場合、蛍光化合物も高温によって分解されてしまうという事でしょうか？ ＞サイズの大きいDNAの方が影響が大きいのは単に ＞dNTP、ddNTPの数的な問題だと思います。 ここはよく分からないのですが。 ＞また熱変性プロトコルを行わないほうが良好な結果が ＞得られるかもしれません。 え、そうなのですか？ 熱変性を行わないと、解像度が悪くなったりしませんか？
- blackdragon
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100℃で5分程度、ボイルすることもあるくらいなので、温度が高いせいでDNAがダメージを受けたとは考えにくいです。 むしろ、98℃よりかなり高かったとすると、水が蒸発してしまったりしませんか？ その場合、サンプルの液量がかなり減っていたのではないかと思いますが。
お礼
ご回答ありがとうございます。 denature用に使っているheat blockは以前から時に調子が悪くなり、一度は98℃にセットしていたのに、140℃くらいになっていた事がありました。 その時はdenature後にサンプルを取り出す際に気付きましたが、確かにサンプル液量が減っていました。その時はサンプルを調整しなおし、denatureもやり直しました。 しかし、最近、結果が悪い時には特にdenature後にサンプル液量が減っているという事はありません。 だから、私はそれほど温度が高いとも思わなかったんですが、他の人達がheat blockのせいにするものでして。 で、確かにheat blockを他のものに替えたら結果がでるようになったんです。 私は泳動用のsampleを調整する際、sampleをFormamideで薄める事があるのですが、特にそれらFormamideで薄めたsampleが極端にピークが低くなる為、最初はFormamideを疑っていました。 しかし、同じFormamideを使って、heat blockを替えて、適当な強さのピークが得られています。 やはり温度なのでしょうか？
お礼
再度、ありがとうございます。 ＞蛍光化合物について、やはり室温で保管しておくと蛍 ＞光強度は低下していくという報告を聞いています。 室温では保管はしていませんが、やはり熱によって何らかの影響があるのでしょうかね。 ＞ddNTPが結合し伸長が停止した各DNA断片はすべてが均 ＞等にあるわけではなく短いものが多く、長いものは少 ＞なくなってしまいます。 なるほど、そうですね。納得です。 ＞熱変性に関しては、...しかしながら結果にかわり ＞はありませんでした。 私も、いくつかのサンプルを熱変性させたものと、させないものとで泳動し、比べてみました。 確かにほとんど差はないですね。 しかしながら、よくみると、わずかに熱変性させたものの方が解像度が良いようです。 私は少しめんどうですが、マニュアルどおり、熱変性させてから泳動します。 ありがとうございました。