ジーンターゲティングについてです。

質問

ファージを用いたゲノムライブラリーから、目的遺伝子をプラスミドにサブクローニングする際、本では「サザンブロット法を用いて（ファージから切り出す）制限酵素部位を決定する」とありますが、何故サザンが必要なのか、が理解できません。丸ごと切り出すための制限酵素は、予めファージの長および短腕に組み込んであるんじゃないの？サザンをするためにEcoとかBamで切断して、そこに何の意味があるの？という疑問です。ぜんぜん理解できなくてもう、泣きそうです。誰か助けてくださいませ。

回答No.5

Anthocyanin · ベストアンサー

#2～3のAnthocyaninです。

なるほど。お気持ちは良く分かります。
実験を始めたばかりの頃はどうしても本が頼りなのですが、必ずしも本の通りには進められない場面ってありますよね。

サザンは絶対にEcoとBamでやらなくてはいけないと決まっているわけではないので、ご自分の目的にあう制限酵素で処理し、予想通りのサイズに切断できていることが確認できればそれでかまいませんよ。

実験の成功・研究の発展をお祈りしています。

お礼

有難う御座いました。当初の疑問は解決しました。書いていて思ったんですが、確かに判らなくて苦しんでいますが、それよりも「この考え方で本当に良いのか」と言う問いに対する、何というか安心がほしいんですよね。まだまだ疑問はありますが、考えても考えてもわからない時は、またよろしくお願い致します。

回答No.6

myahmyah

難しいようですね。
Anthocyaninさんの言うように必ずしもEco、Bamでなければならないということはありえないと思います。
適当な部位が切断でき、且つ利用したいベクターとも相性のいい制限酵素であれば構わないと思います。
すべての遺伝子がEcoとBamで片付くとは考えられませんし。
ただ、その実験書で使用しているベクターがEco、Bamが使いやすいということではないかと想像しますが、いかがでしょう？
サザンを行なうのは、確かにその制限酵素で切断すると、こうした断片ができるということの証明でもあるのかな？とか思いますが。どうなのかな？
難しい話になってくると、知識が追いつかないです。ごめんなさい。

お礼

丁寧なお返事有難う御座いました。当初の疑問は解決しました。今回初めて利用しましたが、質問に対する回答もそうですが、人の優しさが身に染みましたよ。本当に有難うござしました。またよろしくお願いします。

回答No.4

myahmyah

多分ですね、まずEcoで切断しますね。そして、泳動します。そして、目的遺伝子の欲しい領域をプローブにサザンをします。
そうすると、どの断片に目的の部分が含まれるかわかりますね。その断片が適当な長さかどうかも判断できますね。
そうすることで、Ecoで切断するのがいいのか、Bamで切断するのがいいのか、それともその両方で切断するのがいいのか判断ができると思います。
そういうことかなぁとか思いますが、いかがでしょうか。

補足

有り難うございます。私の場合、制限酵素地図を作成済みでして、その地図上にBamEcoの認識部位が、あったんですよ。ターゲティングベクター作製の為には、長及び短腕は有る程度の長さが必要で、EcoやBam処理をしてしまうと、絶対的な長さが明らかに不足してしまうのです。なのでEcoやBamで切ってしまうとベクターとして使えなくなりそうなのです。
　「お前は事前に地図を作っているからそう言えるのであって、一般的な手順ではそうでは無いのだ」
といわれるかもしれませんが、そうじゃないです。
何故ならEcoやBamの認識部位は結構どこにでもあるので、どのような遺伝子でもそれらに対する認識部位がある可能性は高いと思われます。そうすると、ある程度の長さが必要な、ベクターの作成のためには、EcoやBamで切るのは、合目的でないとはじめから予測がつくと思われるんです。しかし本では、それらに対して言及してない。
　確かに、目的遺伝子の分子量を知りたいだけであれば、EcoやBamで処理してサザンをするのはわかります。でも今回の用な場合、EcoやBam処理を敢えてする意味が、上記の様な理由でやっぱりわからないんですね。
　サザンというのは、適当な酵素で切って、目的の遺伝子の分子量を知るのが目的なんですか。それともどの本を見ても、サザンはEcoやBamとかで切っているんですが、サザンとEcoBamはセットなんですか？
　そうではなく、前者をしてサザンというのなら、まあわかるんですがね。

回答No.3

Anthocyanin

#2です。

質問の文章に気を取られていてタイトルに気が付かなかったんですが、これはノックアウトマウスの作成に関する実験なんですね。
動物は専門外なのですが、ターゲティングベクターにおいてノックアウトしたい遺伝子というのは必ずしも全長を含む必要がないと思います。
今回の目的からしますと、
(1)目的遺伝子の開始コドンを含む断片
(2)その直後につながる断片
の２種類を回収して短腕または長腕とし、(1)と(2)の間に薬剤耐性遺伝子を挟む形でターゲティングベクターを構築すればよいのではないでしょうか？

参考URL：

http://www.invitrogen.co.jp/products/molecular_biology/12537002.pdf

補足

丁寧に有り難うございます。参考URLはチェック済みなんですが、PCRを用いたベクターの作製は、ミューテーションが起こる可能性が高いので、まだ一般的では無いようですし、私自身ゲノムライブラリーからのクローニングを進めている最中です。
　そもそも分子生物学に関して、私は度素人な為、常識的な知識が極端に不足しており、現在苦労してます。
　さて、Anthocyanin様の回答の様に、インサート長がプラスミドにライゲーションする為には長すぎるため、10kb以下のものに限定する為に、サザンを行うというのが正しい様です。本によれば、相同組み替えを行うためには長及び短腕は長ければ長いほど良いとあったので、読み違いをした様です。
　それで改めて質問なのですが、サザンを行う際の酵素の種類は、何を用いるのが正しいのでしょうか？　
　と言うのは、成書には用いる酵素は「適当な（一般的な、EcoやBam等の）酵素を用いて・・」と有りますが、クローニングしたい遺伝子に関する制限酵素地図を作製した所、ノックアウトしたい遺伝子近傍の上及び下流の数kbの位置に、EcoやBamの認識サイトが存在していたんですね。
　ターゲティングベクター作製の為には、長及び短腕は有る程度の長さが必要ですが、EcoやBam処理をしてしまうと、絶対的な長さが明らかに不足してしまうのです。
　有る程度の腕の長を得られる酵素は、地図から確認する事が出来たので、それらを用いてインサートを切り出し、長さが10kb以下であることを確認し、プラスミドへライゲーションをするという様に進みたいのですが、これは、サザンと言って良いのでしょうか？
サザンの目的は、検出したい遺伝子の長さや存在を確認する事であって、その為に使用する酵素は、本当に何でも良いのですかね。
それならば本にある「適当な（一般的な、EcoやBam等の）酵素を用いて」と言うのは、何なのでしょうか。
その様な酵素を用いれば、目的遺伝子上にも認識部位が有ることはまず確実なので（事実ありましたが）、有る程度の長さの長および短腕を得られる可能性が減少してしまう事は明らかと思われるのにも関わらず、それでも尚、それらの酵素を進める理由と言うのは何なのでしょうか？
　或いはこれは一般的な事例のためその様に記載しただけであって、上記した私の考え方でも（有る程度の腕の長を得られる云々・・）、サザンと言って問題ないのでしょうか？
　素人はこの様な言葉にいちいち引っかかります。面倒ですが、宜しくお願いします。

回答No.2

Anthocyanin

#1のmyahmyahさんと言いたいことはほぼ同じなんですが・・・

ファージとプラスミドでは組み込めるDNA断片の大きさに違いがあるからではないでしょうか？
つまり、ファージに入っているサイズだとプラスミドには組み込めないことがあるから、いったん適当な制限酵素で切って必要な部分（遺伝子）だけプラスミドにサブクローニングするんじゃないですか？
ファージのインサートサイズだと塩基配列を決定するのも大変（手間とかコストとか）でしょうし。

お礼

ありがとうございました。そうするとですね、ターゲテフィングベクターを作るためには、普通は(1)短腕(2)潰したい遺伝子(3)長腕　の、大まかには三つに分けて、或いはもっと細かく切って、作製してゆくんですかね。塩基配列に関しては、インサートの大きさは解っていますから、両端をある程度シークエンスして、それをblastで検索すれば（ダブルインサートとかになってなければ）どの部分がサブクローニングされたかは解る、と理解しているんですが、駄目でしょうか。駄目ですかね。。

回答No.1

myahmyah

多分ですね、ファージに組み込まれているのはゲノムですよね。
その中の特定の遺伝子をクローニングするのが目的ならば、ファージにある制限酵素サイトで切ると、プラスミドに入るのは、またゲノムDNAになりますよね。
そういうことかと思います。

補足

回答有り難うございました。今度は嬉し泣きしそうですよ。補足しますね。●ターゲティングベクターは、破壊したい部分（単純には開始コドンの近傍）に薬剤耐性遺伝子を組み込むか、或いはもっと単純に、開始コドンそのものを薬剤耐性遺伝子で置換する方法を取るらしいですが、相同組み替えを行うために、上流および下流に数kbの相同部位が必要であり、結果全長が、普通10kb位必要になる。所で、ファージに組み込まれているゲノム断片は、平均が16kb位です。潰したい遺伝子が、この中のどの部位に入っているか、を調べるのは、サブクローニングした後で調べるとして、まずは「スクリーニングしたクローンの中に、目的とする部分が有り、且つ長さがある程度あるかを調べる」為に、「切り出したい制限酵素のみ」で切って、泳動して、プローブで検出して、これら条件を満たしている、と言う過程を経るなら、理解出来るんです。でもそこで、サザンは何で必要なのか、何でも切ってしまうEcoとかBamで処理して泳動して、10kb以下にぶちぶちに千切れた断片を検出して、何を何の為に調べるのか、というのが、わからんのですわ。長いですけど。すいません。