サザンでのコピー数確認

質問

例えば、アグロバクテリウム法で外来遺伝子を植物に導入した場合、そのコピー数、遺伝子がいくつ入ったのかを確認するのにサザンハイブリダイゼーションを用いるんですが、コピー数を確認できる原理がいまひとつ詳しく理解ができません。

ゲノムを制限酵素で切り、泳動、ハイブリダイズした後のバンドの濃さで確認するんでしょうか？それともバンドの数、パターンで判断するんでしょうか？？
基本的なことかもしれませんが、詳しい原理を教えていただきたいです。

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

植物屋ではないので、アグロがどういう形態でゲノムにintegrateするのかわかりませんが一般論で、

１．1コピーずつ異なった場所に独立に挿入する場合
例えば、ベクターの内部を一箇所だけ切る制限酵素でゲノムDNAを切る。そのサイトからゲノム上に現れる次のサイトまでの距離は挿入箇所ごとに異なるので、ベクター配列を含みそれぞれ長さの異なる断片を生じる。これを、ベクターを切った制限酵素サイトから右側、あるいは左側のみのベクタープローブで検出すると、現れたバンドの数が挿入の数に一致する。

２． 多コピーがタンデムに連なって挿入する場合（例えばマウスのトランスジェニック）

基本的には、「ハイブリダイズした後のバンドの濃さで確認する」です。ベクターの内部で二箇所以上切れる酵素で切断して、その断片のひとつ（つまりどのペクター挿入からも生じる同一の断片）をそれと相同のプローブで検出します。コピー数がわかったベクタープラスミドの希釈をコントロールとして、ゲノムDNAと同時に泳動し、バンドの濃さからサンプルに何コピー相当のベクターがあるかを求め、サンプルがゲノム何コピー分に相当するかからゲノム1コピー分中のベクターコピー数を求めるという方法になると思います。
最近では定量PCRを使うほうが洗練されていると思いますが。

お礼

なるほど。(1)の１コピーずつの場合がよくわからなかったんです。そういうことだったんですね。

バンドが複数でてたのに１コピーの挿入だ、としていた論文があったので混乱していたんです。その論文では他の２つの制限酵素処理でバンドが１つだったので結局１コピーとしていたんですが。

どうも丁寧にありがとうございました。

回答No.1

noname#48316

バンドの数で分かります。

「原理を教えて下さい」では、あまりに漠然過ぎて回答が難しいです。

サザンなら、図書館に行けば実験書に必ずのっている物ですから、
ここで質問されるより、本を見た方がよいと思います。

それでも理解できない部分があった場合は、ポイントを突いて質問していただければ、
回答が得られると思います。

お礼

確かに漠然としすぎてましたね。。すいません。
geneticist12さんの回答のようなことが聞きたかったわけです。

わざわざ愚問に対してご回答ありがとうございました！