定量性に欠けると言われるはなぜですか？

質問

はじめまして。
遺伝子発現量を解析する実験で、私の所属する研究室ではRT-PCRを用いています。
（RI施設が無いことと、低コストであること、簡便であること、という理由からです。）
しかし、なぜ一般的に定量性に欠けると言われるのか分かりません。
どなたかご存知でしたら、ご教授ください。

回答No.4

subaru361

学生レベルでごく単純なことを。つまりは、増幅率が理論値からずれることによります。nサイクルのPCRでは、理論的には2^nの増幅率になります。その理論通りに増幅されれば、定量性は問題がないでしょう。しかし、現実のサイクルにおいては、プライマーと鋳型の結合のステップがありますが、プライマーと鋳型の相対比が変われば当然、結合の効率が変わります。サイクルごとに理想的には鋳型2倍づつになるはずですが、プライマーが不十分であれば、2倍を下回ることになります。例えば、あるサンプルの増幅率が1.5倍であったと仮定すると、ほいと電卓をたたいたところ5サイクルで約、7.6倍でした。1.4倍だと約5.4倍の増幅率です。サンプルごとの増幅率を厳密にコントロールすることは困難ですので、増幅過程のない手法に比べて定量性は落ちることは否めません。

お礼

primerの量も目的の遺伝子により振って検討していますので、充分に加えているはずです。
丁寧な回答をありがとうございます。

みなさん、どうもありがとうございました。

回答No.3

geneticist12

ちゃんとコントロールをとれば定量性は高いです。コントロールをとらずにバンドが濃いとか薄いとかで定量したり比較したりするのは説得力がありません。

RNAの総量のコントロール（rRNAやhouse-keeping gene RNAなどの検出）
逆転写効率と絶対量のコントロール（合成した既知量のcompetitor RNAを加える。量を振って目的のPCR産物の量とcompetitor由来のPCR産物量が等しくなる点を検量線から求める）をとれば、real-time PCR以上の定量性があると言っても良いでしょう。

成書などから「competitive PCR」のやり方を勉強してみてください。

お礼

一冊PCRの本を購入してみようと思います。
回答していただき、ありがとうございました。

回答No.2

sachihappy777

こんにちは。半定量は行っておられるのでしょうか？
一般的なPCRでは増幅曲線を描いた場合、
反応系のはじめのほうでは産物は指数関数的にどんどん増えていきます。が、やがて増幅がとまりそれ以上反応系を増やしてもこれ以上増幅がおこらないというプラトーに達します。

例えば25サイクル行った産物を電気泳動してバンドの太さを見た場合
そのサイクル数が増幅途中のサイクルか、プラトーに達してしまったサイクルなのかはこの試験自体（25サイクルの産物のみの泳動）ではわかりません。

プラトーに達してしまったサイクルのバンドの遺伝子量を測定しても必ずしも初期の遺伝子量を反映しているわけではないのです。

お礼

サイクルは20,22,・・・と取っており、プラトーでないことを確認しています。
ということは、自分のやっている方法で自身を持っていいのですよね！？

分かりやすく回答していただき、ありがとうございました。

回答No.1

lamb1204

リアルタイムじゃなくて、単なるRT-PCRですか？

補足

はい、そうです。
逆転写のほうです。
よろしくお願いします。