この操作方法でおかしい点はありますか？

質問

マウス組織からのRNA抽出なんですが、以下のプロトコルで実施したのですがどうもμg/μl辺りの濃度が薄いので正しい操作方法か不安です。
実験をはじめてまだ数ヶ月というのもありハンドリングが悪いのも否めないのですが、プロトコルに問題があればそれを直したいとも思っています。
よろしくお願いします。

(1)液体窒素で凍らせた組織を乳棒ですりつぶす
(2)組織にtrisolを添加してエッペンチューブにうつす
(3)シリンジを通す
(4)室温で5分置く
(5)クロロホルムを添加して約15秒voltex
(6)室温で3分置く
(7)14000rpm 4℃ 15分遠心
(8)上清を回収
(9)回収できた上清と等量のイソプロピルアルコールを添加
(10)室温で10分置く
(11)14000rpm 4℃ 10分遠心し上清除去
(12)75％エタノールを添加しvoltexする
(13)14000rpm 4℃ 5分遠心し上清除去
(14)風乾
(15)(14)後、DEPC水にsuspendする
(16)OD測定
わたしがこの作業でおかしいなとおもう点はどのようにして、RNAを沈殿させているのかが分からない点なんです。
シークエンサーなどをかける際にはエタノール沈殿をすると思うのですが、ここではしていないのでなぜしないのかが分かりません。
よろしければ教えて下さい、お願い致します。

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

>どうもμg/μl辺りの濃度が薄いので

それだけだと、収量がいいのか悪いのかわかりませんよ。濃度なんか、どれくらいの体積の溶媒に溶かすかでどうにでもなりますから。
何gの組織から始めて、最終的にどれくらいの体積に溶解して濃度がなんぼだっか、さらに言えば濃度に総体積をかけた、総収量が何ugだったか。
おおざっぱに言って、total RNA量は出発材料の重量の1 %くらいです（ゲノムDNAはそれよりさらに1/10くらい）。

>エタノール沈殿をすると思うのですが
この場合、プロパノールで沈殿しています。エタノールで沈殿するときは溶液に対して2～3倍体積を加えますが、プロパノールは沈殿する作用が高いので、1/2～1倍体積を加えます。

>(12)75％エタノールを添加しvoltexする

vortexはやってはいけないこととは言いませんが、塩などは自然に拡散、希釈されますので必要ないです。vortexをかけると沈殿がはがれたり、細かく砕けたりしてロスしやすいです。

>(15)(14)後、DEPC水にsuspendする
>(16)OD測定

水溶液だとRNAのODは低めになります。測定時の希釈は中性付近のバッファーを使ってください（もちろんブランクはそのバッファーでとります）。

回答No.3

otx

この作業は、ごくごく基本的なことです。
まして、エタノール沈殿がないという疑問をお持ちになっているくらいの質問者様の疑問は、卒業した先輩でなくてはしらない情報には入りません。

＞さすがに指導教官の方や修士の方も同じ研究室の人のテーマといえどもそこまではわかっていないので

そんなことありません。この作業はたぶん指導教官や修士くらいであったら知っていると思います。基本的な作業ですから。

もっと研究室の方とコミュニケーションをとることをお勧めします。
その方が早いです。

回答No.2

otx

プロトコールに問題があるとは思いません。

(9)がエタノール沈殿に並ぶ核酸の沈殿法「イソプロ沈殿」です。

通常、(11)で沈殿したペレットはチューブからはがれにくいですが、
(13)で再度ペレットをチューブの底に集めるたときには、はがれやすいです。
ペレットが目に見えるときはそれをなくさないように気をつけることです。
初心者がよくロストするステップです。

もし、目に見えないペレットを扱っているのであれば、遠心するときにセットするチューブの向きをいつも同じにしておき、
目には見えなくても、ここに見えないペレットが存在するはずだ、と気をつけながら操作することをお勧めします。

あと、私はいつも思うのですが、初心者のうちはむしろこのようなところで疑問を解決するのではなく、担当教官や先輩に直接聞きましょうよ。
そのための担当教官であり、先輩です。
担当教官が忙しそうと勝手に気を使うこともあると思いますが、教官サイドからすれば聞いてこない学生ほど厄介な存在は無いと思います。
私の研究室でこのようなサイトで質問していたら説教が始まると思います。

がんばってください。

お礼

回答ありがとうございます、そしてすみませんでした。
言い訳がましいかもしれませんが、私が担当しているテーマをおこなっていた先輩は1年前に卒業されており、その先輩のノートをいきなり渡されたものですから、どこを見るべきなのかもわからない（←さすがに指導教官の方や修士の方も同じ研究室の人のテーマといえどもそこまではわかっていないので）まま困り果てていたのにやることがどんどん増えてきてあたまがこんがらがってしまい本で調べるなどの行為をせずここで質問してしまいました。
これからは本で調べた後にそれでもわからない場合は、担当教官や技術員の方に聞いてみようと思います。
本当にすいませんでした。