MPOアッセイ

質問

私はある組織のMPO活性を測定しようと思っているんですが、それに先立って、キットの試薬が使えるかどうかを見るために、スタンダードの検量線を引きました。

このキットはMPO の塩素化活性を蛍光検出するもので、塩素化反応により生成した次亜塩素酸（HOCl）との反応により，基質 APF が蛍光物質 Fluorescein に変化することを利用しています。この検量線をプロトコール通りエンドポイントで測りました。

A 0nM
B 5
C 10
D 25
E 50
F 100
G 150
H 200

プロトコールの例によるとグラフは、縦軸蛍光強度で、横軸フルオロセイン濃度において、Hのポイントで約20000程になっています。y=105.7x-53ぐらいになると書かれています。
しかし、やってみると、 バッファーだけのはずのAにおいて10000ほどの蛍光強度がありそこから20000まで伸びていく直線のグラフや、Aでは0でもHの部分で10000ほどといったグラフになってしまいます。どちらも傾きはプロトコールの半分ほどです。どちらもr二乗は1に近く、希釈の手技は問題ないと思われます。何が原因なのでしょうか？

条件は室温、蛍光波長範囲485-515で黒プレートでやっています。

宜しくお願いします。

回答No.1

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バックが安定しないというのは測定機器の不備が原因だと思います。
手技に問題ないのであればそれしか考えられません。
プレートの色をあえて記載しているのは、それが重要であるということですか？
色違いの新品のプレートを1枚ずつ用意して、全てのwellにAを入れて測定すれば、
プレートの色が原因か、測定機器が原因か分かるんじゃないでしょうか。