HPLC分析がうまくできません。

質問

HPLC分析がうまくできません。
詳しくは書けませんが、移動相はリン酸Na緩衝液（イオンペア試薬も含む）:アセトニトリル=85:15で、測定波長は210nm、カラムはODSカラム(3μm、φ3mm)です。
移動相は脱気しても泡立ちやすいです。
トラブルの現象はベースラインがいつまで経っても安定せず、検出器セルの透過光が不足になってしまうようです。（セル中に生じる泡が原因と思っています。）
そもそも移動相の組成に問題があるのか、調製方法に問題があるのか困っています。
カラム圧も上昇しやすい傾向にあるのであまり流速を上げれずにいます。
原因や対処策はありますでしょうか？

回答No.4

Peanuts0804

ベースラインの安定に関しては気泡がわかっているのであればを取り除いてみてはいかがでしょうか。
圧力に関してはサンプル由来のマトリクス成分の可能性もあるのでメンブレンのフィルターを通したり固相抽出を行ってみるのはいかがでしょうか。

回答No.3

km1939

私の経験から判断すると。
　(1)．移動相の吸光度が高いのが原因でベースラインが安定しないことはありません。
　　　（流量が不安定の場合を除く）
　(2)．検出器セルの透過光が不足になってしまう→逆から見れば吸収量が多いということです。
　　　通常移動相の透過光不足になることはないので、原因は脱気不十分と思います。
　(3)．どうしても脱気がベースライン安定に影響するならば、移動相の混合割合を変えて見て下さい。

回答No.2

elpkc

No.1の回答者です。

吸光度は水を対照にといいましたが、検出器は、空気を対照に測定しているので、
リファレンス側には何も入れないほうがいいかもしれません。

>ただ、移動相の吸光度が高くてもHPLCカラムやラインが平衡化すればベースラインは安定すると思うのですが…。

ただし、210nmでは相当安定しにくいと思います。
例えば、250nmでも安定しませんか?

その波長で安定するなら、やはり移動相が問題の可能性が高いと思いますが。
検出器かもしれませんが。
セル中に移動相がある状態でポンプを一旦停止し、そのままでベースラインを確認するとどうですか?安定していますか?
その辺りを確認してみてください。

回答No.1

elpkc

脱気は、組成が変わりやすいので、条件を決めて行う必要がありますが、
超音波＋減圧のほうが脱気されます。

それで行われているならば、デガッサーを通して方がいいですね。
セル内の気泡の場合は、のこぎり波形状のベースが確認される場合が多いです。

この場合たぶん波長が210nmなので移動層の吸光度が高すぎて
透過光不足になっているものと思われます。

水を対照に移動相を210nmの吸光度を測ってみてください。

お礼

回答ありがとうございます。
超音波での脱気はしてませんでしたがデガッサーは通してます。
移動相の吸光度は測定してみます。
ただ、移動相の吸光度が高くてもHPLCカラムやラインが平衡化すればベースラインは安定すると思うのですが…。
吸光度の度合いとベースラインの安定は別問題のような気もします。