mRNAの定量をしたいと思うのですが

質問

マウスプロラクチンレセプターmRNAを定量したいと思ってますがcompetitor RNAの作り方がよくわかりません。そのため、抽出したRNAを逆転写してPCRで増幅し、サザンブロットを用いて定量したいと考えています。もしこの実験に関して知っていることがありましたらどうか教えてください。お願いします。

回答No.1

noname#4684 · ベストアンサー

王道はノーザンブロットのシグナルをデンシトメーターでバンドシグナル強度を測定し，ハウスキーピングとの割り算で値を出すこと．
　（プロラクチンのノーザンシグナル）÷（G3PDHのノーザンシグナル）の数字で棒グラフを書く．

２番目は半定量リアルタイムPCR．しかし機会がないとこれはできない．

３番目はご指摘の通りコンペティター入りRT-PCR．作り方は，制限酵素などでPCRプロダクトサイズがあまりにもマザーのサイズと変化しないようにデリーションすればいいんじゃないですかね（僕もよく知りません，すみません）．

「そのため」以下の案は，PCRしてしまったら，mRNA量にバイアスがかかる．1st strand　合成ののち，PCRしないでドットブロットするほうがいい．
　*しかし，それならなぜRNAのままドットブロットしませんか？　逆転写することでRNAではなくなるから扱いやすくはなりますが，手順が入れば入るほど，もとのRNA量からかけ離れていきます．

お礼

ありがとうございました。
これらを参考にして方法を考えたいと思います。

回答No.3

k9999

#2さんの言うようにＲＴＰＣＲではだめですか？作業的にサザンよりラクに出来ますよ。

回答No.2

noname#17364

こんにちは。
　ご質問でおっしゃるような方法では定量性はないと思いますよ。PCRをかけるとsaturateしますから、もとのtemplateの量を反映したシグナルは得られません。
その辺で売っている実験書を見れば、こういった実験の方法はいくらでも書いてあります。まずはそういったものをきっちり読んでみた方が良いと思いますよ。

　やっぱり1番さんのおっしゃるようにNothernか、QC-PCRか、もし機械があるならばReal-Time PCRか、アレイでしょうか。やりかたは実験書を参考にするべし、です。頑張ってください！