定常期の大腸菌を使うのはなぜ？

質問

コンピテントセルを用いてプラスミドＤＮＡを増やすとき、
死滅期に入ってから回収するのではダメなのでしょうか？

大腸菌をＭＡＸまで増やして、その大腸菌が死んでから回収するとき、どんな不都合があるのかが、よくわかりません。

これまで、単に「無駄に長時間培養しても効率が悪いから」だと思っていたのですが、どうやら大腸菌が死滅期に入ると不都合があるようだということを聞き、どうしてだろうかと考えています。
死んだ大腸菌が破裂してゲノムＤＮＡが混入してしまうから、というようなことなんでしょうか？？

回答No.3

Dr_Hyper · ベストアンサー

大腸菌をＭＡＸまで増やして、その大腸菌が死んでから回収するというのがどの程度かによると思いますが、増殖をしないというだけであればクロラムフェニコールによってタンパク合成を遮断して増殖しない状態にして数日間培養することでlow copyのplamisdを大量調整するといった方法もあります。一般にmini prepも二日ぐらい培養しておいても大丈夫で、むしろRNAが壊れてくれるのでplamisdがキレイになるという人もいるぐらいです。しかしながら大腸菌が弱ってくれば当然菌体内の酵素も弱ってくるわけでplasmidが不安定な状態になったり（メチル化などで守っていますので）うまく複製が完了せずにplamisdダイマーなどが生じる可能性ふえてきます。むろんゲノムが断片化されれば精製時に混入してきますのでこれも問題です。
以上のことからもキレイなスーパーコイルのplamisdをとりたいのであれば常識の範囲で定常状態になったら止めるのが得策ですね。あととにかく２０時間程度で十分なところを日数をかける輩がでてくるので、良くないことが起きるというひともいるかも知れません。

お礼

回答ありがとうございます！
色々な角度からお答えくださって、非常に参考になりました！
一先ず納得です！

回答No.2

otx

駄目であるという明確な理由を実験的に確かめたことはありません。

実験している者として、多分みんな感覚的に持っていると思う感覚を根拠に言います。

何か実験をするとき、うまくいっているうちはいいですが、
うまくいかないときはいろいろ理由を考えて確認していくと思います。

そんな中、普通の実験者は、すぐに「あれが問題だったかも」と思いつくようなリスクは最初からなくす方向で実験しているはずです。

また、実験をする前に、試薬などの調整は基本通りに行って、
特別にチェックしなくてもいいように実験をするはずです。

そんな感じであると思うので、わざわざ大腸菌が死にはじめてプラスミドを回収するということを好んでする必要があるでしょうか？

「どんな不都合があるか」と考える前に、「不都合がある可能性がある」と感じた瞬間に、するべきではないと私なら思います。

大腸菌が死にはじめても、普通にプラスミドが取れるよって、定常期の大腸菌と比較（回収量、純度、プラスミドcc、ocなどの比率、プラスミドの大きさによってどうかとか）してチェックするなどすれば安心するかもしれませんが、
そんな手間をかけるなんて私は嫌です。

＞どうやら大腸菌が死滅期に入ると不都合があるようだ
といった人も、確かな根拠ではなくて感覚的なものかもしれません。

わざわざリスクを負いたくない（死んだらいろいろネガティブなことを思いつくでしょ？それが普通の感覚だと思われる）。

これが理由ではないかと。

お礼

アドバイス有難うございます！
確かに、わざわざ問題があるかもしれないことを行う必要性は感じられないですよね…。

＞根拠ではなくて感覚的なものかもしれません。
というのに、納得しました。

回答No.1

de_tteiu

回答がないようなので…

死滅期に入ると起きる不都合については思い当たりませんが、そもそも長時間やっていると抗生物質が切れてしまいますよ

お礼

アドバイスありがとうございます！
確かに抗生物質失活は問題ですね
「死滅期に入ると不都合があるようだ」というのが何なのか気になっていたのですが、
単純に抗生物質がダメになるっていう理由でいい気がしますよね。