SDSのサンプルバッファー処理のタイミング

質問

今、卵子の透明帯をSDSPAGEしようと考えています。
サンプルバッファーに試料を入れて、熱を加えた後に冷やしてサンプルインするのはわかるのですが、どの段階でストックしておくのが望ましいのでしょう？
熱を加える前に冷凍保存した方が良いのでしょうか？また熱を加えた後に、サンプルインまで凍結保存しておくのは平気でしょうか？

よろしければご教授していただければと思います。

回答No.5

otx

＞サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります

＞200kda以上の巨大蛋白で、もともとvivoでも不安定な蛋白でそうでした。

もともと不安定なタンパク質ということなら、SDSのサンプルバッファーでどうこう言うものでは無いと思います。

もともと、SDSサンプルバッファーは、SDSをきちんとタンパク質に結合させる過程がなければ、その意味を持ちません。
そのため熱を加えたり、少なくとも室温で数時間処理するといった過程が無いと、毎回の実験ごとにSDSがタンパク質に結合する度合いが違うということになります。

回答No.4

ga111

>横レスになりますが、どのようなタンパク質でそういうことがあるのでしょうか？

200kda以上の巨大蛋白で、もともとvivoでも不安定な蛋白でそうでした。TCAで前処理して、プロテアーゼをより強力に不活性化しても、そうなりました。当該サンプルは、コントロールとして、１０回以上しようしておりますので間違いではないでしょう。

「卵子の透明帯」については経験がありませんが、加えて、サンプルバッファーを入れないで保存できるならそれも試してみるといいでしょう。ちなみに８-９割くらいの蛋白は大丈夫かも（すべて同じ結果になる）しれません。

回答No.3

otx

＞まじめにやるのなら、両方試します。サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります。非加熱のサンプルも試すといいでしょう。

長年タンパク質をメインにつかった解析をしている者として、
「SDSを加える条件では」、このようなことは聞いたことありません。

横レスになりますが、どのようなタンパク質でそういうことがあるのでしょうか？

回答No.2

ga111

これは、対象の蛋白によるので、一般論はありません。

まじめにやるのなら、両方試します。サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります。非加熱のサンプルも試すといいでしょう。

回答No.1

otx

熱を加えた後に、保存するのであれば凍結すればいいです。

ただ、次に泳動で使う場合、また熱を加えてアプライしましょう。
この辺のことは基本的な実験書に書いてあるので、
労せずやり方は手に入ると思われます。