pGEX-6p-1の形質転換
GEヘルスケアのベクターを使ったライゲーションとトランスフォーメーションがうまくいきません。以下に実験の概要を書きますので、どこに原因があるのか分かる方、アドバイスよろしくお願いいたします。
Total RNA抽出
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cDNA合成
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目的遺伝子の部分配列(1521bp)プライマーでPCR
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5'(Foward)末端にBamH1配列、3'(Reverse) 末端にStop Codon 配列を組み込んだプライマーで上記のPCR産物をテンプレとして再びPCR
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ゲル抽出
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ライゲーション(p-GEM-T-easy Vector Systems, Promega)とトランスフォーメーション(大腸菌はDH5α)
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コロニーPCR(M13プライマー)でインサートチェック
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プラスミド抽出
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シークエンス解析(全配列は読めなかったが、BamH1、Stop Codon配列は確認)
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制限酵素処理(BamH1、EcoR1)、同時にpGEX-6p-1ベクターも同じ制限酵素処理
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ゲル抽出
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ライゲーションとトランスフォーメーション(大腸菌はBL21、GEから購入し、自分で培養)
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コロニーPCR(pGEX sequencing Primer使用、ただし、経費節減のため、GEのものではなく、Operonに作ってもらった)
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なぜか、160bpくらいにバンドが出た
pGEXのライゲーションにはp-GEM-T-easy Vector Systems(Promega)を流用しています。
BL21には空ベクター(pGEX)が導入されることはコロニーPCRで確認しています。
後、制限酵素処理したベクターに脱リン酸化処理などもしてみましたが、結果は同じでした。
ですので、おそらくライゲーションがうまくいってないのでは、と思います。しかし、どうすればよいか分からないため、困っております。長文ですいませんがよろしくお願いいたします。
お礼
ありがとうございました。 とても参考になりました これらの方法の中でできるものは。ためしてみたいと思います。