pENTRベクター。コロニーPCRができず困っています
こんにちは。インビトロジェンのpENTR/D-TOPOクローニングキットを使って実験しているものです。
Gatewayのエントリーベクターを作成すべく、pENTR/D-TOPOに2kbpのDNA フラグメント（PCR産物）を入れることを試みました。しかし、遺伝子を大腸菌にトランスフォームした後、出てきたコロニー30個を楊枝でつついてコロニーPCRをかけたところ、期待していたインサートのバンドが全く検出されませんでした。
がっかりしましたが、念のために同じ大腸菌を培養してそこからプラスミドを精製し、PCRをかけてみたところ、実はなんと2kbpフラグメントはかなり高い確率でpENTR/Dに入っていたのです。pENTRを使うとこの現象が必ず起き、困っています。
ちなみに、大腸菌DH5α、ベクターpGEM-Teasyの組み合わせで使用したときには、このような現象は起きませんでした。コロニーPCRはKOD',最初に９５度５分で処理しています。
精製したプラスミドではPCRはうまくいったのに、なぜコロニーPCRではダメだったのでしょうか？このような事を経験された方はいませんか？それはどのように改善されましたか？コロニーPCRができないと沢山のプラスミドを精製しなくてはいけないので不便しています。
