EMSA実験でのinternal control（内部標準）

質問

EMSAゲルシフト実験を行っている者（基礎医学系　修士）です．必須ではないと思うのですが，EMSAで核内タンパク量のnormalizationを行うため，非制御タイプの核内タンパクのdetectionを行おうと思います．文献からオリゴは注文しました．
　しかし，internal controlとしてのオリゴとタンパクの反応手順が分かりません．実際にオリゴとタンパクを反応させる時，目的とする（タンパクーオリゴ）と（タンパクーinternal control用オリゴ）を同一tube内で反応させてゲルの同一laneへapplyするのでしょうか？それとも，別々のtubeで反応させて，別々にゲルのlaneにapplyするのでしょうか？
　経験者の方，ご回答の程，宜しくお願い申し上げます．

回答No.2

nonnon1190 · ベストアンサー

>そうするとapplyタンパク量を揃えたつもりでも別tubeで反応させていると，必ずしも目的（オリゴータンパク）のinternal controlにはならないですよね．

核内タンパク量のnormalizationを行うためなのですよね？

単純に、例えば100μlの核タンパク溶液（濃度などどうでもいい）を二つに分けてそれぞれに別のオリゴを入れればいいじゃないですか？

補足

ありがとうございます．お返事が遅くなり申し訳ありません．

２つに分けるのですが，EMSAって結構ピペッティング誤差が生じ易いように思うので，それでいいのかな～？と思っていました．

結局，nonnon1190さんの仰るように，２つに分けて行いました．detectionしてみると，目的としたいバンドとnormalize用のバンドの位置がかなり近かったので，やはり，別々にやるしかないのな～，と思いました．

余談ですが，westernだと，同一membraneで抗体を反応させるので，normalizeしている意義が高いように思います．

ともかく，基本的な質問に丁寧に回答して下さったnonnon1190さんに，感謝申し上げます．

回答No.1

nonnon1190

＞EMSAで核内タンパク量のnormalizationを行うため，非制御タイプの核内タンパクのdetectionを行おうと思います．

よく意味がわかりません。非制御タイプの核内タンパク質？

ゲルの同一laneへapplyしたらどんなパターンになると思いますか？
判別しづらくないですか？

補足

早速のご回答ありがとうございます．

説明不足で申し訳ありません．非制御系のタンパク（転写因子），というのは，外部刺激によって変化しないものの事です．オリゴはOctやNF-Yなどが用いられたりします．今回は，NF-Yをinternal controlとしてみようとして，文献や関連商品を売っている会社のprotocolを参考にsequenceを確認してオリゴDNAを注文しました．

確かに，ゲル同一laneへのapplyはnon-specificなものなのかナンなのかごちゃごちゃになりそうです．cold competitorをどう加えるかも問題になると思いますので，やはり別tubeにてタンパクーオリゴを反応させ，別々にapplyするのでしょうかね～．私も別々の方がバンドが分かり易くなると思うのですが，そうするとapplyタンパク量を揃えたつもりでも別tubeで反応させていると，必ずしも目的（オリゴータンパク）のinternal controlにはならないですよね．そこは仕方無いのかな？