出芽酵母でのGFP

質問

出芽酵母で、GFPを用いてタンパク質の局在を調べたいと考えています。
実際に行っている方、お勧めの製品を教えて下さい。
また、GFPとの間には何残基程度のスペーサーを入れてますか。
その他、始めるに当たっての注意点があればお願いします。

発現させたいのは、分子量98k程度で、膜への局在が示唆されている物です。
宜しくお願いします。

回答No.2

cholerae · ベストアンサー

補足要求しておりながら，今一きちんと回答できないと思いますが，示唆できる範囲で書きます。
　Yeastのベクターとしては主に次の２種類ということになっています：YIps (Yeast integrating plasmid) and YCPs (Yeast centromeric plasmid)。代表的な論文としては，Niedenthal, R. K. et al. (1996) Yeast 12, 773があるようです。この文献は検討したかな？
　ここから先は自信がないのですが，上記のような巨大ベクターはいろいろなプラスミドを結合させて作っているようです。多分，個々のプラスミドは市販されていると思いますが，GFPと目的蛋白のfusionを簡単に組み込めるようなキットは市販されていなかもしれません。
　いずれにせよ，私の紹介した本は９８年までの成果は網羅してありますから参考になると思います。
　GFPと目的たんぱく質との結合に何残基程度のスペーサーを入れるか？という質問ですが，この手の仕事はcase by caseで答えは貴君の研究次第だと思います。目的たんぱく質のＮ末側に入れるのか？それともＣ末側か？　これによっても目的たんぱく質の活性や局在性に影響を与えるでしょう。もちろん，fusion proteinの蛍光量子収率が下がってしまってはだめでしょう。本によると，GFPのどの変異体を使うかでも結果が異なってくるようです。
　現実問題としては，すべての組み合わせを試すことは不可能でしょうから，最初の出発点が大事でしょう。やっぱり，文献を精査し，かつ，経験のある研究者に直接問い合わせして，最初のベクターデザインを考えることがよいと思います。

お礼

再度の回答ありがとうございます。
choleraeさんのアドバイスの通りに、文献の精査をしたいと思います。
基本に立ち、紹介していただいた論文から始めることにします。
ありがとうございました。

回答No.3

meineko

わたしのあんちょこは、
GFPとバイオイメージング　宮脇敦史編　羊土社　(2000年)
です。

CLONETECHのEGFPをつかって、酵母でGFP-Rer1pタンパク質を発現させている例が載っています。

ちなみに、植物と大腸菌ではGFPを発現させたことがありますが、酵母はよくしりません。

お礼

回答有り難うございます。
私の手元にあるのがまさしくpEGFPベクターなので、その情報は助かります。
早速手に入れます。
有り難うございました。

回答No.1

cholerae

まず，補足要求です。お勧めの製品を教えて下さいとありますが，どんな製品のことを指しているのかわかりません。ベクターのことを指しているのかな？
　質問の内容を見ると，GFPをプロモーターアッセイに使うというのではなく，fusuion proteinを作って細胞内での局在を見ようとしているというふうに理解しています。これでよいのかな？
　いずれにせよ，ここで議論するには，ちと大きすぎる問題であり，この質問の内容では答えようがないように思います。
　私の手元に貴君の参考になる本があります。タイトルはGreen Fluorescence Proteins (Academic Press).その中のChapter 16 Monitoring the Dynamics and Mobility of Membrane Proteins Tagged with Green Fluorecence Proteinという章があります。すでに読んだかな？　多分参考になるはず。興味があれば，返事を！

補足

choleraeさん、回答ありがとうございます。
補足させて頂きます。

＞ベクターのことを指しているのかな？
はい。クロンテックのカタログなどを見たのですが、出芽酵母用の物を見つけられませんでした。
使用されているコドンの使用頻度が出芽酵母に合っているものがあればと思い、質問しました。

＞細胞内での局在を見ようとしているというふうに理解しています。

まさしくその通りです。
現在までに機能についての報告か全くないタンパク質なので、局在も含めた解析を行いたいと考えています。

＞ここで議論するには，ちと大きすぎる問題であり
確かに、そうかもしれません。
皆さんの回答を拝見していると、驚くほど専門的な回答が寄せられているので、ついつい頼り過ぎていたかもしれません。
ただ、「分からなければ聞けばいい」といった安易な気持で質問しているわけでは無いことをご理解下さい。

＞この質問の内容では答えようがないように思います。
もう少し具体的な質問をさせて頂きます。
実は、mammal用のGFPベクターはあるのですが、当然の事ながら酵母では発現しません。
そこで、このベクターからGFPの配列だけを酵母用のベクターに移す事を考えています。
その際、mammal用，酵母用GFPの配列にどの程度の差があるのかが知りたく、質問しました。
本来ならば新たに酵母用のベクターを購入すべきだと思います。
しかし、予算の都合上それはちょっと....

＞私の手元に貴君の参考になる本があります。
残念ながら、その本は私の大学の図書館にはありませんでした。
早速、近辺の図書館を調べてみます。

ありがとうございました。