電気泳動でバンドが出ない理由（学生実験）

質問

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

大腸菌のコロニーに
TE/RNaseA
↓
NaOH（アルカリ変性させた）
↓
NaOAc（中性に戻した　大腸菌のゲノム：ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド：元に戻る）
↓
phenol/chlorophorm（ph層：大腸菌のゲノム　　水層：プラスミドをふくむ）
↓
水層をとりだしてisopropannol加える
↓
ethanol（洗浄）
の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし、私がやったサンプルはバンドがだいぶ薄くなってしいました。
その理由がわからず悩んでおります。

予想としては、phenol/chlorophormをいれて遠心をかけて油層と水層にわけたときに、二つの層の間に白い層（タンパク質が含まれているらしい層）があり、水層（プラスミド含）を取り出す際にそれをピペットで吸ってしまったことが原因だったのかな、と思っているのですが、その根拠などもわかりません。

どなたかわかる方がいらっしゃいましたら、教えてくださると幸いです。

回答No.1

masazoh · ベストアンサー

バンドが薄くても検出されてるなら、学生実験ならまぁOKではないでしょうか。

　原因としては、エタノール沈澱洗浄の際、プラスミドまで吸ってしまったり、あるいはもともとサンプルに極端にプラスミドが少なかったりしたこと、あるいは上清分離の際にプラスミドあるいはゲノムの層を取る量が少なかったなどが挙げられるのではないでしょうか。

　あるいは電気泳動の際に、希釈でミスしてたりも考えられます。

　ご検証ください。

お礼

ありがとうございました♪
参考にさせていただきます！！！

回答No.3

tatoo

自分が見ていないところで、ほかの人がやった実験の失敗したところはどこかというのが一番難しい質問です。
それこそすべてのステップに原因となるものがあり得ます。
そこで私がお勧めするのは、市販のきちんとした参考書に目を通してみるということです。おそらく図書館に、少なくとも何かしらの実験の参考書が置いてあると思います。ネットに書いてあることは正しくても７、８割です、回答としてあるものにも結構間違いがあります。それを見て質問者が納得されるのは心が痛みます。
そこで私は、確かな参考書をひとつ挙げたいと思います。

秀潤社「バイオ実験イラストレイテッド」のシリーズなどはいかかでしょうか。

DNAの抽出は基本的な作業なので、詳しく書いてあると思います。

お礼

そうですね。
理系の学生としてこうして疑問を解決するというのは後ろめたさもありいつつ、質問しました。。

おすすめの参考書を紹介してくださってありがとうございました！！

回答No.2

geneticist12

No.1さんも書かれているように、よくありがちなのはProOH沈殿、EtOH洗浄の過程で上清といっしょにDNAをロスしてしまうことです。
ほかに意外とあるのは、最初に菌体が懸濁されていないために、ダマになっていてNaOH/SDSが十分効かず、溶菌が完全にいっていないことがあります。
こういうときはダマが見えたり、濁りが残って見えます。

フェノール抽出で中間層を取ってしまっても、タンパク質がコンタミして純度が下がるだけで、プラスミドの収量には影響しないでしょう。

蛇足ですが、書かれている手順とその効果の理解に不正確なところがあるようです（そう教えられたのかしら）。ご参考に
http://oshiete1.goo.ne.jp/qa2262183.html

お礼

ご丁寧に私の間違いまで指摘していただいて助かりました。
「ニックが入って…」ってところですよね？？
ありがとうございました！！