ノーザンブロッティングのプローブ

質問

ノーザンブロッティングの際のプローブについて教えて下さい。
当然、プローブにはRNAかDNAを使う事になりますが、両者の違いが分かりません。
単純に、ハイブリダイズ効率の違いかなと考えています。
出来れば、DNAプローブを使いたいので、皆さんの経験をお聞かせください。
標識にはDIGを使おうと考えています。

回答No.2

noname#4684 · ベストアンサー

ノザンプローブはＤＮＡでもＲＮＡでも、どちらでもいいです。プラスミドの状態ですでに手もとにあるのなら、制限酵素で消化してゲルから切り出し、ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｄ法で標識したＤＮＡプローブでいいでしょう。

ＲＮＡプローブのほうが厳密にいうと高級かもしれません。なぜなら、上記のランダムプライム法でつくったプローブは、センス鎖のほうは無駄になりますね。ハイブリできるのは、ＲＮＡと相補的な配列だけですから。おなじく、ＲＮＡプローブをつくるということは、アンチセンス鎖という、本当に自分が必要なものだけをプローブとしてつくっているという意味で、いいストラテジーといえます。無駄なプローブが混入した状態で実験を行うということは、ノイズを上げる可能性があると言えます。また、ＲＮＡプローブは、ＲＮＡですから分解されやすく、扱いや実験操作に多少の熟練を要求します。ＤＮＡプローブの法が簡単です。こういう点からも、ＲＮＡプローブのほうが、高級と言えると思います。

まあ、普通にＤＮＡプローブでいいと思いますよ。自分もノザンするときは、よほどそうしたい事情がないかぎり、ＤＮＡプローブを使います。

あと、ＤＩＧの件ですが、非常に注意したほうがいいと思います。うまくいかないのです。前のかたも回答してくださっている通り、なぜかＤＩＧでノザンはうまくいかないんです。自分も経験があります。このことは、野村慎太郎先生の書いたプロトコル本、「脱アイソトープ実験マニュアル」に載っています。もし、大学のかたであれば生協ででも立ち読みしてみてください。かならず置いてあるぐらいの有名な本です。

お礼

回答有難うございます。

実は、RNAを扱うのも初めてなので、sa ke no miさんの指摘されたように、
RNAプローブの分解が心配です。

プローブの種類だけではなく、DIGラベルの問題もあるのですね。
教えていただいた本をよく読んでみようと思います。
DIGが上手くいかない時には、RIを考えた方が近道なんでしょうか。

回答No.1

skc_yuichi

現在DIGを使ったプラーク・ハイブリをやっており、後々DIGノザンを
やろうと考えている者です。

DIGラベルDNAプローブでのノザンは私の周りでも結構失敗しているようです。
ロシュでもシグナルの強度、非特異的シグナルの抑制のためにRNAプローブ
を推奨しているようです。

cerevisiaeさんが確認したいRNAの濃度がどれくらいか分からないので断言
はできませんが、お金に余裕があるならRNAプローブでやってみてはいかが
でしょうか？（ちなみにうちには余裕がないのでDNAプローブでやらなければ
いけないかも）

お礼

アドバイス有難うございます。
DNAプローブでのノザンは大変そうですね。
ロシュがRNAプローブを推奨しているのは知りませんでした。

うちもお金は厳しいのですが、習いに行った先がRNAプローブ
を使っていたので、そのまま導入することになったんです。
教えて下さった方は、簡単そうにやられていたのですが、
目で見るのとやるのでは大違いですね。
とりあえずはRNAプローブでがんばろうと思います。