細胞の染色

質問

免疫染色について質問があります。今Cell-lineを使って免染をしているのですが、成功したのかしていないのかがよく分かりません。
なぜかというと、発色基質を入れた後、一次抗体でアイソタイプを用いた群だけが発色し、抗原特異的な一次抗体を用いた群は何の変化もなかったからです。普通は逆で、アイソタイプ群は発色しないと思うのですがどうなのでしょうか？この時はアイソタイプ群に基質を入れるとすぐに発色したので、すぐ止めました。
また、最後にヘマトキシリンを入れるわけですが、これの役割は抗体が付着している領域以外を染めるということで良いのでしょうか？

回答No.3

wriwri

指導してくださる先生とお話されることをお勧めします。それからプロトコールといってもそれこそ十人十色ですので、他のプロトコールを参照することはできますが、それをそのまま使うことはできないです。いくつかプロトコールを集めて自分なりの系を作成してください。

ちなみに。。。

一般的な手順は以下の通りです。
１）固定、２）ブロッキング、３）一次抗体、４）洗い、５）二次抗体、６）洗い、７）封入、８）観察。

群
１）アイソタイプ抗体＋２次抗体、２）目的の抗体＋２次抗体、３）アイソタイプ抗体のみ、２）目的の抗体のみ、３）１次、２次抗体ともになし、４）ポジティブコントロール（１次）抗体＋２次抗体。

ポイント
１）ブロッキング（ＢＳＡあるいはＢＳＡ＋２次抗体を作成した動物のＮｏｒｍａｌ　ＩｇＧ）

２）洗浄の方法

３）１次抗体の濃度と２次抗体の濃度

お礼

何度も質問してすみませんでした。
是非参考にさせて頂きたいと思います。

回答No.2

wriwri

質問者さん１次抗体が目的の抗原を認識すること、そしてその抗体が染色に用いることができるという証拠があるという前提でお話します。

アイソタイプ抗体が細胞を染色することは多々（というかしょっちゅう）あります。その原因として抗体濃度が高すぎること、またはアイソタイプ抗体といっても中にはオリゴ糖を認識している抗体もあります（カタログで確認してください）ので要注意です。また、２次抗体のみ、１次抗体も２次抗体もないという２つの対照群もとって、観察される反応が１次抗体によるものかどうか検討する必要もあるように思います。

質問者さんの場合、おそらく１次抗体との反応の前に行うブロッキングがうまくいっていないような印象をうけます。通常、ＰＢＳー１％ＢＳＡで室温１時間あるいは４度でＯｖｅｒｎｉｇｈｔでブロッキングしますが、質問者さんはどのような方法をとっているのでしょうか？

また、２次抗体に結合されたＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ等の酵素を発色に応用していると思いますが、その場合細胞に存在する内在性の酵素の不活化はされていますか？

お礼

内在性ペルオキシダーゼを不活化するために、Peroxydase-blocking-reagentを使っているのですが、BSAなどタンパクを使ってのブロッキングはしていません。プロトコールを見るとその過程は入ってなかったので・・・。

回答No.1

wriwri

実験の詳細が不明ですので、適切な答えにはなっていないと思いますが、以下のことを参照にしてください。

１）１次と２次抗体の濃度の組み合わせ：まずアイソタイプ抗体と２次抗体の濃度（希釈率）を振って”染まらない”範囲を決める。次いで、その範囲で抗原特異的な抗体を用いて染色する。ポジティブ・コントロールの抗体を使っていますか？

２）全ての抗体は使用直前に１４ｋＲＰＭで遠心してその上清を用いる（抗体はアグリやすいので）。

３）１次抗体の特異性：本当に目的の抗原を認識していますか？染色で用いることのできる抗体はほとんどウェスタンでもいけますので、それで確認されたらいいでしょう。

４）そのほか、細胞の固定（アルコールかＰＦ）プロトコール、発色法（基質の選択、蛍光法）、抗体と細胞のインキュベーション時間と温度、抗体を希釈するバッファー、ブロッキングの方法（溶液と時間・温度）各ステップでの洗い方、などなど検討することは沢山あります。

また、ヘマトキキシリンはＤＮＡと主に結合しますので、目的の抗体が染めている細胞の位置を確認する”Counter staining"です。

実験を始める前に指導してくださる先生と充分時間をかけてお話してください。

お礼

ご回答ありがとうございます。
私の勉強不足だと思いますが、アイソタイプ抗体を用いても基質と反応することはあるのですか？アイソタイプ抗体濃度は一次抗体と同濃度に加えると教えてもらったのですが、基質を入れるとすぐに発色が始まるのはやはり濃度が濃いためでしょうか？