リアルタイムPCRについての質問です。

質問

PCRまったくの初心者です。
cDNAを作成してそこからRT-PCRを回して解析するという方法をとっています。
前任者の引き継ぎで、比較する検体を追加して解析する必要があるのですが、
前回前任者が用いていた陰性コントロール（A群）をPCRにかけてところ、Ct値が検出されませんでした。
プライマー・プローブなどはまったく同じでA群のCt値だけ出ず、最近採取した検体からはCt値が出ています。　以前（2年前）作成され、-20℃で保管されていた検体を用いたのですが、失活してしまったということなのでしょうか？

また、この場合当時の陰性コントロールの遺伝子発現量と今回採取した検体との間で遺伝子発現を比較することはできないのでしょうか？

回答No.3

jkpawapuro

cDNAの溶媒はTEですよね？
そんな簡単に分解しないはずですが？

お礼

ご回答ありがとうございます。
ご指摘の通りだと思います。TE希釈し，-20℃で保存しています。
文献や教科書をよんでもそんなに簡単に分解しないと思っていましたが，研究者によっては，実験を繰り返して解凍、保存を繰り返す過程で分解しうるとの説明でした。
内在性コントロールのGAPDHは発現しているようですし、ますますよくわからないです。もう少し調べてみます。

回答No.2

noname#259842

PCR初心者とありますが、リアルタイムが初めてということですか？
実験の目的としては、遺伝子の発現解析を行っているのですね。RNAからcDNAを逆転写して、それを鋳型にPCRを行い、元のRNA量を定量化するという、ごく一般的な方法だと解釈しました。

話がちょっとそれてしまいますが、
>RT-PCRを回して・・・・・
>-20℃で保管されていた検体を用いたのですが、失活してしまったということなのでしょうか？

あまりこういった表現を使わない方がいいと思います。
学生さんならば特にです。まあ、ラボ内では日常的にPCRを回すと言うかもしれませんけど、適切な表現じゃないですよね？
酵素なら機能を失ってしまった状態、構造を保持していない状態を「失活」と表現しますが、この場合の「検体の失活」とは何を意味しているのでしょうか？
RNAやcDNAのことを指しているなら「分解」が正しいです。

さて、本題に戻って、プローブを使っているという記述から、TaqManプローブを用いた検出だと推察されます。
陰性対象群のRT-PCRを行って、Ct値が検出されないとのことですが、そもそもCt値とは任意に設定した閾値と増幅曲線が交わる値（Threshold Cｙcle)のことを指しています。
任意に設定した閾値というのは、初発DNA量およびPCRサイクル数に応じて立ち上がってきたPCR増幅曲線を実験者が判断して決めるものです。Ct値が検出されないというのは、この任意の閾値が適切に設定できていないのではないですか？
あるいは、鋳型のｃDNA（もしくはその前のRNA）が分解されており、PCR反応による増幅がほとんど見られない状態なのではないですか？まずは、この２点を確認することをお勧めします。
PCR増幅が見られるのかどうかは、普通にPCRをして、電気泳動すれば確認できますよね？

それから、そもそも陰性のコントロールで、PCRの増幅がみられちゃっていいんですか？
実験の内容がわからないのでそのあたりは的外れかもしれませんが、一般的に陰性コントロールっていったら、何もでないっていう比較対象を指しています（例えば、試薬類に汚染がないことを証明するためなど）。
普通、発現解析なら、恒常的に転写されている遺伝子を陽性コントロールとし、それとくらべてある条件下もしくは複数の対象検体間でのある遺伝子の発現量を検出すると思いますけれど。

-２０℃の検体というのがどの状態（細胞？RNA？）なのかわからないですけれど、永久に保存できるわけではないので、実験的な操作ミスがないと確認した後は、検体を新しくして、陰性と陽性コントロールを取り直して、再実験するのがベストです。
また、プライマーとTaqManプローブも新しいものにされた方がいいでしょう。
どのように保管されているのかにもよりますが、小分けにして、凍結融解を繰り返さないように使用していないと、分解が起こっている可能性があります。実際に経験したことがありますので、特にプローブの保存には注意が必要です。

お礼

ありがとうございます。とても参考になりました。
10月から実験を始めた大学院生です。いろいろ言葉がおかしくなりすみません…。
2種類の病気のモデル動物を作成、それぞれの組織からcDNAを作成して
2群間の疾患での遺伝子発現をPCRで比較Ct法による相対定量を用いて比較する実験をしていました。
周囲の人に確認しても、おそらく（cDNA -20℃保存の）古い検体のcDNAが分解したのだろうということでした。
大変勉強になりました。

回答No.1

jkpawapuro

リアルタイムPCRって毎度結果が狂うすごく微妙な奴なので、一からネガティブコントロールも前回の実験で利用したのと同じ旧検体も新検体も全て同じ状況で採取しないと駄目だと思います。