マウス胚のPFA固定について

質問

マウス胚のパラフィン切片を作成しているのですが、いつも検鏡すると組織が崩れたような状態になっており、困っています。大まかな形状は保たれているのですが、前肢・後肢・後腸の部分の組織がボロボロに崩れています。
胚生10.5-11.5の矢状切片です。4%PFA/PBSで4℃ o/nで固定しています。
色々悩んだ末、固定をブアン固定にすると、このような問題が解決するので4%PFA固定では、どうも固定がゆるいようです。
しかし、免疫染色する場合、ブアン固定は使えません。
PFA固定で組織切片を行いたいのですが、何か解決策がありましたら、よろしくお願い致します。以下に、私のラボでのPFAの条件を示します。
PFA…ナカライの電顕用粉末
PBSに量った粉末を入れ、10N NaOH添加し60℃で溶解した後、氷冷、フィルターろ過して、15mlファルコンチューブに分注・－25℃保存したものを使用直前に溶かして固定液として使ってます。pH7.2にしてます。

回答No.1

bunnosukehina · ベストアンサー

単純に固定時間が短いと思います。
胎生11.5dayぐらいなら形もはっきりしてくるので、4%PFAの4℃なら24時間以上固定したほうが良いのではないでしょうか。ブアン液は酢酸の作用で組織浸透力がもともと高い固定液ですので、5-6時間でも固定はできると考えられます。
免疫染色をするときは、抗体にもよりますが、普通の中性ホルマリンでも検出できる場合が多くありますし、bouin液が悪いとも一概には言えないと思います。
カルノア固定液のような凝固型の固定液を用いるのもひとつの手だとは思いますよ。

お礼

ご回答、どうもありがとうございました！
明日、早速解剖・PFA固定を行いますが、固定時間を長くする予定です。24時間以上は置いてみます。