MTTアッセイについて・・・

質問

96ウェルプレートを使って細胞に対するサンプルの影響とサンプルに対する刺激物（過酸化水素など）の影響をMTTアッセイ（n＝4又は6）を用いて同時に見ようとしています。
サンプルをDMSOに溶かし、それを規定の濃度になるように希釈してウェルに蒔こうと思っているのですが、DMSOには細胞に対する毒性があると聞いております。

(1)DMSOの最終濃度はどうしたらよいのか？
(2)プレートにはどのようにサンプル・過酸化水素を蒔いたらよのか（コントロールを何にしたらよいのかなど）？

また、MTTアッセイをする際注意しなければいけないこと（細胞数と前培養時間、細胞生存率を計算する際必要な吸光度など）、改善したらよい点、こうしたら効率がよいのではないのかという点があれば教えて下さい。宜しくお願いします。

回答No.1

ponroom · ベストアンサー

流し読みしかしていないので適当ですが参考になれば。
まずDMSOが毒性があるのではとの事ですが、毒性があると思うのであれば一度DMSOのみを処理してチェックしてみてはどうでしょうか？
細胞と言っても色々ありますし、assayに対するDMSOの影響もチェックする必要がありますので。
まだassayをどの様に行ったら良いのか分からない段階でしょうか？
「サンプルの影響とサンプルに対する刺激物の影響」の箇所の意味がいまいち掴めていないかも知れませんが、
細胞を撒いただけのwellをコントロールとして、サンプルのみを処理したwellとサンプルと刺激物の両方を処理したwellを作ってMTT assayを行ってはどうでしょうか？
それからサンプルの処理の方法ですが、
96wellは中央の60wellだけを使うのであれば、
wellを横向きにし、左端に培地とサンプルを処理して段階希釈していけばn=6での処理ができるかと思います。
ただn=6は多いのではないでしょうか？
学会用のデータ取りなら良いのですが、単にスクリーニング等を行うのであれば、n=2で十分だと思います。
それから比色法で生存細胞数を検出すると思うのですが、
対照波長での測定も一度は行っておいた方が良いと思います。
MTT試薬と培地との誤発色を検出できますので。

補足

回答ありがとうございました。

「サンプルの影響とサンプルに対する刺激物の影響」の箇所は「刺激物によって引き起こされる細胞障害に対するサンプルの影響」の間違いでした。

サンプルを溶かした時に使った溶媒であるＤＭＳＯの影響をみるためにＤＭＳＯをサンプルの代わりに使った【ＤＭＳＯ＋培地】と【サンプル＋ＤＭＳＯ＋培地】のものを比較してＤＭＳＯの影響をコントロール（細胞を蒔いただけのウェル）を含めて４点、刺激物の方はコントロール（サンプルを加えてないウェル）を含めた６点とってｎ＝４でみようと思うのですがどう思いますか？

回答No.2

ponroom

#1です。
質問の意味をやっと理解しました。
もし私がその実験を行なうとした場合、
１．【細胞のみ】：コントロールとし、この値を100として溶媒やサンプルを処理したwellを相対的な値で表す。
２．【細胞＋DMSO】：細胞に対するDMSO（Sampleを溶解する溶媒）の影響をみる。複雑なassay系な場合、細胞に毒性を与えているかどうかだけでなく、assay系に対する溶媒の影響をチェックする必要があるので必ず行なう。
３．【細胞＋DMSO＋Sample】：２と比較する事により、Sampleの純粋な影響を見る事ができる。
４．【細胞＋DMSO＋Sample＋刺激物】：３と比較する事により、刺激物処理された細胞の障害性に対するSampleの影響が確認できる。
１のwellは全てのwellのコントロールになるので多めに取ると好ましいと思います。
例えばn=10とか。これがぶれると全く意味がないので。
コントロールを100として、毒性があれば80や60などに下がる訳です。
２のDMSOの影響を見る実験は、同じ実験を何枚も行なうのであれば、
最初に確認するだけで良いと思います。
論文などに使う最終的な確認実験であれば、同じプレート内で行なった方が良いでしょうが。
３のwellは４の実験を意識した実験になります。
４の結果が本命といった所でしょうか。
n=4で行いたいようですが、私としては余りお勧めしません。
n=2で行なえば同じプレートの空いたwell内でサンプル調整ができますから。
n=4ですとレプリカプレートを作成して8連で同じ位置に加えていく感じになるかと思います。
何度も言いますが、論文用などならそれでも良いかと思います。
ただのスクリーニング等であればn=2で十分だと思います。
MTTassayは余程不器用でなければ失敗しませんし。
MTTassay以前に細胞の扱いに不慣れであれば全く意味がありませんが。
ちなみに一番最初の質問(1)にある「DMSOの最終濃度はどうしたらよいか？」と言う質問ですが、
私とは薬剤処理の仕方が違うようですので余り参考になる事は言えないのですが、
できるだけ高濃度のSampleを処理（これにより加えるDMSOの量が減る）方向で問題ないと思います。
ちなみに私が行なった実験系においては、
DMSOの終濃度（培地に対するDMSOの濃度）が0.1％で影響がなくなりました。
元々レプリカプレートを作成してそれを移していく感じで薬剤処理する予定だったんですね。
普段私が行なっている1枚のプレート内で薬剤処理する方法と異なるので理解するのに時間がかかりました。
これが思い込みによるいわゆる「バカの壁」と言うやつでしょうか…。