ルシフェラーゼアッセイについて

質問

初めてルシフェラーゼアッセイを行う予定の初心者です。
コンストラクトの作製から実際にアッセイを行うまでに上手くいって大体どのくらいの期間が予想されますでしょうか。論文などをみて大体のステップはわかったのですが、周りにルシフェラーゼをやったことのある人がいないので、もしやられたことのある方いらっしゃいましたら教えて頂ければと思います。宜しくお願い致します。

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

プロモーターアッセイを行うということでしょうか。

コンストラクトの作製はプラスミドの切り張りなので、

pGL3などのルシフェラーゼ発現ベクターがラボにあるか、
事前に入れたいプロモーター配列などが適当なプラスミドにクローニング済みか、
ルシフェラーゼ発現ベクターにプロモーター配列をサブクローニングするためにいいサイトがあるか、それともPCRで制限酵素サイトを入れてサブクローニングするか
など、どこまで材料があるのかによります。

既にpGL3などがあって、プロモーター配列もすぐ切り出せるのでしたらコンストラクトの作製は2日以内に終わりますし、
まずプロモーターをクローニングしたり、ベクターを買うところから始めるのでしたら数週間かそれ以上かかるかもしれません。

コンストラクトが出来て大量調整さえ出来たのならば、
後は、トランスフェクションに数時間(前の日に撒くのを入れても2日)
トランスフェクション後に何時間後にアッセイするのかは実験次第ですが、
細胞を回収後は1~2時間(タンパク質濃度を測るのならば＋数時間)で測定可能です。

自分でやっているのはベクターは既にあるものを使っていて、
初日にトランスフェクションする細胞を撒く(1時間弱)
2日目にトランスフェクション(待ち時間を含めて計3時間位)
3~5日に細胞回収(それぞれ1時間弱)
5日目に全部まとめて測る(待ち時間を含めて1~3時間)
位のタイムコースでやっています。

お礼

早速の回答有難うございます。私はCYP2B6のプロモーター領域の多型についてアッセイを行う予定です。pGL3のベクターは研究室にあるようです。となると、コンストラクトを作成して大量調製までが山場という感じですね。そこまでなるべく早く行えるように頑張ってみます。