コザック配列の必要性

質問

実は、あるベクターにc-MycタグをつけてショウジョウバエのS2細胞で発現差背用としているのですが、その際にKozak sequenceは必要でしょうか？
文献等には、Kozak sequenceがあった方が細胞内でのタンパク質の発現レベルが高いとのことが書かれていましたが、実際にどれほどの重要性を占めているのか分かりかねています。
ただ、発現させるだけなら開始コドン(ATG)をつけておけばいいような気もしますが、どうなのでしょうか？
詳しい方がいらっしゃいましたら、ご教授願います。

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

Kozak配列CCACCaugの中で、augの３塩基前がピリミジンになると翻訳がほぼ完全に起こらなくなるのだと記憶します。

ショウジョウバエではCavener (1987)が翻訳開始のコンセンサスを調査していて、
RNNaugで始まる例が95-98%であるのに対し、
YNNaugは2-5%で全く例外的、しかも
YNNaugYは全くない
という報告をしています。（R=プリン、Y=ピリミジン）
Kozak配列そのものである必要はないかもしれませんが、
YNNaugにしてしまうのは無謀といえるでしょう。

＞挿入した遺伝子にもタグがついておらず
タグは発現させるタンパク質fusionにするものだと思いますが、C末端側につければ、入れた遺伝子がもつ本来の翻訳開始がそのまま使われるのでは。

お礼

大変詳しい説明をありがとうございました。
開始コドンの３塩基前がピリミジンになると、翻訳がおこらなくなるのですね。と言うことは、開始コドンよりもその部分の重要性の方がより大きいんですね。
C末端側につけると言うことも考えたのですが、入れる遺伝子が３’UTRも含んでしまっているので、終止コドンが入ってしまい、タグの配列まで読まれないと言うことになってしまうと思ったからです。

回答No.4

geneticist12

＞C末端側につけると言うことも考えたのですが、入れる遺伝子が３’UTRも含んでしまっているので、終止コドンが入ってしまい、タグの配列まで読まれないと言うことになってしまうと思ったからです。

でしたら、今あるベクターにMyc配列を挿入するより、PCRでインサート＋Myc配列を増やして、空のベクターに入れるのが確実で早いと思います。
3'側のプライマーを終止コドンより上流から設計して、それにin-frameでMyc-tag配列（＋クローニングのための制限酵素サイト）を付加すれば良いと思います。Myc-tagは最低でも3コピーくらいほしいところですし、制限酵素サイトもつけるとなると、相当しっぽが長いプライマーで、オリジナルの鋳型に対しては不安定になります。そこは、２段階PCRで最初の数サイクルはアニール温度を低め、あとは高めにすればいいでしょう。

お礼

最初からインサート＋MycタグをPCRで増やして、ベクターに入れると言うのは率直な方法ですね。ただ、相当長いプライマーになるので、うまくPCRで増えるかがポイントになりますね。
他のタグ、例えばヘマグルチニンタグ等でも大体３コピー位をつけて、同じような方法で目的の配列を増幅することも可能と言うことですよね。
早速試してみます。いつも丁寧なご回答ありがとうございます。

回答No.2

MIYD

追加です。
ベクターや発現させたい遺伝子やタグにkozak配列はついていないのですか？
ぎりぎりのところで削っているので無ければ、どれかにはついていると思いますが。

回答No.1

MIYD

実験の目的がよくわかりません。
「発現させるだけなら」と書いてあるということは
タンパク質の大量調整が目的ではなく、
微量でも発現すればいいという実験なのでしょうか。

kozak配列は無くても発現する”かも”しれません。
哺乳類細胞だとkozak配列が完全でなくても高発現するものがあります。

Drosophilaでkozak有り無しで翻訳効率を見ている論文は見たことがありませんが、
インビトロジェンで扱っているS2細胞のトラブルシューティングでは発現量が少ない、又は無いことの原因の一つにコザック配列が無いことをあげています。

http://invitrogen.com/content/sfs/manuals/schneidercells_man.pdf

すでにkozak配列のないベクターが出来ているのでしたら試してみる価値はあると思いますが、
期待している発現量がどの程度であれ、あえてこれからkozak配列が無いベクターを作る利点はあまり無いと思います。
(kozakをつけるためのプライマー代がかからないことくらいでしょうか)

vitroの系なので参考になるかわかりませんが、Fig.4にkozak有り無しの翻訳に与える影響がのっています。
http://www.promega.com/enotes/features/fe0009_print.htm

補足

少し説明不足でした。すみません。
S2細胞に発現させたタンパク質をウエスタンブロットと免疫沈降で用いるのですが、残念なことにベクターにも、挿入した遺伝子にもタグがついておらず、仕方なく自分でカスタムオリゴを頼んでMycタグを入れようという計画でした。そのオリゴを注文する際に、Kozak配列を入れるべきかを悩んでいたのです。