酵素精製のゲル選択について

質問

ペクチナーゼを精製するために、
DEAE-Toyopearlを使い、
フラクション分画を行いました。

pH7.0の燐酸bufferを流し、
NaClで勾配を付けて溶出させたところ、
分子量60Da付近のタンパクが3種出てきました。

この後、これらをどう分けるべきか悩んでいます。
分子量が近いため、分子量分画はダメでしょう。
DEAEの後のCMカラムは逆に出るだけだから
ダメだとの指摘があったので、これもイマイチ。

何か良い手はないでしょうか？

回答No.3

protozoa · ベストアンサー

BlueやRedなどの基質特異性の低いアフィニティクロマトを使ってみてはどうでしょうか。

クロマトを行う前に、少量の試料と担体で、バッチ法により吸着と溶出条件を確認するのがよいと考えます。たとえ、目的とする酵素が吸着しなくても、他のタンパク質が吸着されて、担体を通過させるだけで、純度が上がると言うこともあります。

なお、実験の際には、必ず温度条件も考慮しましょう。
私がアルドースリダクターゼの精製に、先の担体を使用したときには、室温と低温(4℃)で吸着性が全然違いました。
論文を書く段になって、そのことに気づき、温度をコントロールすれば、もっと純度が上がったはずなのにと、後悔したことがあります。

蛇足ですが、

>分子量60Da付近のタンパクが3種出てきました。

とありますが、60kDaの間違いでないですか、タンパク質にしては、異常に分子量が低いような気がするのですが(それとも、私の学生時代とは、単位の桁が変わったのでしょうか)。
ちなみに、分子量の測定は、どのように行ったのでしょうか? SDS-PAGE or ゲルろ過

以上、ご参考になればよいのですが。

参考URL：

http://www.tosoh.co.jp/hp_inx.htm

補足

回答ありがとうございます。
分子量はＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認しました。
分子量は、６万だったはずです。
酵素なので、こんなものだと思ったのですが・・・。

回答No.2

FINFINFIN

>DEAEの後のCMカラムは逆に出るだけだから
>ダメだとの指摘があったので、これもイマイチ。

必ずしもそうとは言えないですよ。目的は分離なのですから、３種類が分画できればいいわけですよね？
たとえばｐＨを４～５付近まで落としてＣＭカラムにかけるという手段はやってみる価値はあると思いますよ。目的タンパクの安定ｐＨを無視して言ってますが。

あとＤＥＡＥでまがりなりにもピークが分かれたのであればカラムの長さを長くするのもひとつのテだと思います。

回答No.1

blackdragon

分子量・イオン交換の溶出位置が近い場合、まずは、疎水クロマトにかけるのが一般的だと思いますよ。