プラスミドコピー数の測定

質問

どなたか親切な方、ご教授ください。
プラスミドのカタログによく「Copy Number >500」などと書かれていますが、何に対して５００なのでしょうか？また、その測定方法をお教えください。よろしくお願いいたします。

回答No.2

mizu_atsu · ベストアンサー

正確にですか？
うーむ、やったことないですからね。
泳動だとかなりアバウトになります。
正確にするとしたら電気泳動ではなく
溶液の吸光度からDNA量を算出してはどうでしょう？
計算式は忘れましたが260nmと230nm？での値から算出できたように思います。
（もちろん染色体やRNAは完全に除いてやってください）

お礼

ありがとうございました。参考にさせて頂きます。

回答No.3

blackdragon

ちょっとした補足です。

プラスミドのうちpUC系のもの（pBluescript等）は、培養温度によってコピー数が著しく変化しますので、測定されるのなら、その辺りにも気を配った方がいいと思います。

また、増殖のフェーズ（対数増殖期か、定常期初期か、定常期か）によってもかなり違うと思います（細胞のサイズも変わるくらいですから）。

お礼

blackdragonさんありがとうございました。
参考にさせて頂きます。

回答No.1

mizu_atsu

ひとつの細菌の中に500以上複製があるということでしょう。

測定したことはありませんが
その微生物を培養し、プラスミドを抽出。
電気泳動して染色し、バンドの濃さからDNA量算出（基準は既知のDNA、例えばマーカー）。
事前に測定した微生物の個数（個/ml）とプラスミドDNAの量およびその大きさからコピー数が算出できると思います。

お礼

mizu_atsuさん、ありがとうございました。
泳動後バンドのシグナル強度で比較しているのですね。
デンシトメーターで比較する際、データ誤差が激しくて、あまり正確ではない気がするのですが、もっと厳密に調べるにはどうしたら良いと思われますか？（電気泳動の際はプラスミドを１カットする制限酵素で切断後、泳動してます）
補足：もう一つの方法としては、大腸菌などではコピー数が既知のプラスミドを導入して、（バンド強度を）比較するなども考えられると思いますが、その菌に使用するプラスミドでコピー数が既知のものがありません。どうしたら良いと思われますか？ご教授ください、よろしくお願いいたします。